随着全球基因治疗市场的高速增长，腺相关病毒（AAV）因其能长期表达、毒性低、免疫原性低、组织特异性高等优势，已成为基因治疗领域最重要的基因载体之一。而 AAV 产品价格高昂，主要在于其工业化生产的多个方面未得到全面优化，如何降低成本、扩大商业化生产力是 AAV 基因治疗产业化最大难题。
带着这些问题，丁香园专程联系了广州派真生物技术有限公司（以下简称「派真生物」）创始人/董事长李华鹏先生，作为一名资深的行业从业者，他是如何看待 AAV 在基因治疗领域的独特地位和发展趋势，以及派真生物在 AAV 产品研发生产方面取得了怎样的技术突破。
李华鹏 派真生物创始人/董事长
丁香园：细胞与基因治疗（CGT）是当前生物制药领域最有前景的方向之一，已成为当前国内外药企的「必争之地」。其中，腺相关病毒载体（AAV）是基因治疗领域当之无愧的主流载体。那么 AAV 载体有哪些临床优势呢？
李华鹏：AAV 载体在基因治疗有以下几个方面优势。
第一点，AAV 载体的免疫原性较低，安全性非常高。自 1990 年代首次用于治疗囊性纤维化的人体临床试验以来，AAV 载体就以其安全性著称，这标志着 AAV 作为基因治疗工具的一个重要里程碑。目前， AAV 载体已广泛应用于遗传性疾病、神经退行性疾病、眼科疾病和心血管疾病等多种疾病的临床治疗中，尚未出现因 AAV 载体本身导致的致死事件。
第二点，AAV 载体感染人体组织的范围非常广泛。已经发现自然界中有上百种血清型，具有较好地靶向不同类型细胞、组织或器官的能力。虽然某几个常用的天然 AAV 血清型已经用于基因治疗药物的项目上，但感染效率仍不够高，并且容易聚集到非治疗目的器官-肝脏。例如，某些需要静脉注射的上市药物因高剂量引发肝毒性，甚至有两名儿童因此不幸离世。我们用 5 年多时间建立并打磨成熟的π-Icosa™ AAV 血清型筛选平台，已经在灵长类动物的多种重要组织中筛选出具有高组织专一感染力、且不感染肝脏的 AAV 血清型，如果用在基因治疗上，不仅能大幅降低 AAV 载体的使用剂量和生产成本，还能避免常见的高剂量 AAV 注射导致的肝毒性，极大提高治疗的安全性。
第三点，AAV 载体的基因表达稳定性也是其独特优势之一。感染非分裂细胞或组织后，AAV 载体的环化基因组能够实现一针注射后长期稳定的基因表达，这对于需要持久性治疗的遗传性疾病尤为重要。
总而言之，AAV 载体的这些独特优势使其成为基因治疗领域中最有前景的基因载体。但是，AAV 目前也还并非完美，产量要提升，在感染力和特异性上也要提升，首次注射后由于宿主产生中和抗体而不能重复注射，以及装载基因容量偏小的问题都有待解决。这是整个基因治疗领域，包括派真研发团队多年攻关的核心问题，希望能打造出更好的基因治疗载体，让大家用得起，用得好。
丁香园：病毒载体工艺及大规模 GMP 生产的难度极高、工艺复杂、产能短缺和制备周期较长，是 CGT 药物开发的主要瓶颈之一，所以「需要革新生产技术，将产量提上来」，派真生物有哪些技术革新？
李华鹏：作为专注于 AAV 载体生产的 CRO、CTDMO，「提产量」是派真生物的主要技术攻关目标之一。我们在 2021 年就建成了亚洲首个 4000L 总产能的临床级 AAV 载体生产基地（鲲基地），实现了临床级的规模化生产。十年来，我们在生产技术和工艺上持续努力，从未停歇。
我们的 π-Alpha™ 293 细胞 AAV 高产技术平台，就是一个整合「提高体系基础产量、优化生产工艺和流程、国产物料筛选替代」等多维度成果的平台，达到提高产量并降低成本目的：
首要的是体系基础产量，是基于多项已获授权的专利成果，包括对 RC 和 Helper 辅助质粒做的提升产量的专利设计，配合我们自己开发的高产单克隆细胞株，再加上提升产量的增强剂，总体能让原本较低的 AAV 载体产量翻 5 到 20 倍以上；其次是生产工艺，我们以 QbD 的理念为指导，优化上下游工艺条件，因此，AAV 载体的终产量相比未优化前还能提高多达 10 倍，下游回收率也能超过 40%；第三是国产物料筛选，我们不仅仅提高产量，还对生产关键物料进行筛选，找到众多的国产替代物料，在降低成本方面做到了极致。
现在，我们单批单罐 AAV 载体生产能提供 1E+17 vg 量级的病毒原液，这足以满足大多数临床和商业生产的需求了。总结一下：我们从基础产量、工艺优化和物料替代等方面深度优化打造的高产低成本平台，已完成了上百批次的 GMP 中试样品制备，成功交付了十余个中美的申报项目，帮客户项目快速进入了临床阶段。
丁香园：AAV 研发的过程中，空衣壳、宿主基因组残留、基因组完整性等质量问题都是需要关注的风险点，在工艺放大后这些质量问题的表现则更为突出。针对该问题，派真有哪些解决方案？
李华鹏：质量问题是项目成败的关键。AAV 载体的成药性问题是基因治疗药物从早期研发、POC 到 CMC 之间过渡的一个关键点，其中载体设计在 CMC 中的表现需要在药物研发的早期纳入成药性考虑。
关于载体设计，派真团队很早就注意到，载体设计对成药性的影响是许多客户的一个盲区。比如许多客户并不清楚原先质粒的 ITR 不完整，或者表达的基因序列对 AAV 的产量或者质量有影响，极大增加了成药性的难度，甚至需要从头设计载体，相当于推倒重来，再从概念验证实验开始，浪费大量的时间和资源。
针对这个痛点，我们近年来在 AAV 载体设计上做了深入探索，筛选出简洁而创新的设计，一方面确保 ITR 的完整性和合规性，另一方面配合我们的 π-Alpha™ 293AAV 高产平台技术，可以最大限度降低将来在 CMC 上「卡脖子」的概率。
我们极力推荐客户在最早载体设计阶段采用派真的 AAV 载体骨架，并且已经放到了官网载体设计平台「派载体」上，供客户免费使用。「派载体」（英文 piVector）骨架能确保合规性和提升成药性，大幅提升项目成功率。
此外，在项目初期，我们建议进行基于 CMC 平台的小规模生产测试，通过产量、杂质残留、空壳率、基因组完整性等指标，综合评估生产工艺和产品的成药性。这样，我们能早点发现潜在风险，为后面的工艺选择和优化提供方向，提前规避药物开发中的风险。
我们有十年以上的 AAV 项目经验，建立了一个完善的 AAV 载体成药性研究平台，分析中心装备了先进的仪器，比如三代测序、LC-MS，具备全面的质量表征和质量研究能力。由于 AAV 载体的复杂性，确实带来了质量研究的挑战。但我们的 CMC 团队通过研究数百个 AAV 药物，积累了大量关于基因组完整性、衣壳稳定性和工艺相关/产品相关杂质的数据，总结出了优化策略和经验：
首先是杂质残留，派真团队对上游和下游工艺多个关键点的进行优化，在上游端控制 HCD 的产生，同时在下游强化 HCD 的去除能力。目前，AAV 载体的悬浮工艺可将 HCD 残留在 50 ng/1E+13 vg 以下。同时 HCP 残留、质粒 DNA 残留等关键质量标准均控制在行业领先水平，极大地提高了 AAV 产品的安全性。
其次是基因组完整性：基因组完整性往往会在早期研发中被客户忽视，但深刻地影响 AAV 载体的 CMC 表现。GOI 和 RC 载体设计、上游工艺和纯化工艺路线的选择均不同程度的影响基因组完整性。例如某 AAV8 载体的项目在成药性测试中发现其包装的 AAV 基因组呈现碎片化分布，下游纯化难度极大。派真 CMC 团队通过载体设计和生产工艺的综合优化，帮助客户把 AAV 载体的基因组完整性提升到 80% 以上，纯化后的 AAV 实心率高达 90%。
接下来是空壳率（纯层析工艺）：业界普遍认为超离去空壳在商业化生产时，会面临一系列的挑战，然而纯层析去空壳对下游工艺有着极高的要求，派真生物团队通过下游填料筛选、buffer 筛选和工艺条件优化等，在保证纯化回收率的同时，大幅降低最终产品中的空衣壳，例如在某 AAV2 载体的成药性研究中，派真通过系统性的阴离子层析优化将原液空壳率控制在 5% 以内，并在中试放大生产中稳定重现。同时，派真团队也非常注重 partial AAV 的纯化工艺优化，在某项目执行过程中，我们团队通过上下游工艺的努力，将 partial AAV 的含量从约 30% 大幅降低至 10% 以内。
最后再说下制剂稳定性：AAV1、AAV2、AAV6 以及大量新型突变体衣壳在生产过程中往往会遇到病毒聚集、冻融稳定性差、加速稳定性差等挑战，派真制剂研究团队通过大量的平台制剂处方研究，解决病毒聚集卡脖子问题，可以为多元化血清型的 AAV 药物制剂稳定性保驾护航。
总的来说，AAV 载体的质量问题是与早期的 GOI 载体设计和血清型衣壳选择相关的。在项目早期，应充分评估项目的规模化可行性，排查候选载体在生产工艺上的风险。在后续的工艺路线选择和工艺优化过程中，针对项目难点进行重点突破，确保 AAV 载体的上游产量和下游回收率的同时，降低产品的杂质残留，提高基因组完整性和制剂稳定性。
丁香园：随着越来越多的基因治疗制品进入临床或上市，基因治疗制品的质量控制也面临诸多挑战，例如对 AAV 载体的结构表征和其他特性分析不够深入、检测项目及标准限度还不完善，甚至很多项目缺少有效的检测方法等。派真生物在质量研究和质量控制方面是怎么应对的？
李华鹏：从 2019 年来，我们看到行业在病毒工艺优化的产量提升方面，至少实现了 50% 的年均增长，而在质量控制上，监管要求在细节上越来越高，这些都是行业进步的表现。派真生物不仅在工艺上获取行业领先的发展，同样我们在质量研究方面一直保持前瞻性。在基因治疗领域的质量研究和质量控制方面，主要通过全面的分析质控平台、注重体系建设、持续的质量研究投入，来应对目前基因治疗日新月异的质量控制发展和要求。
首先，我们来聊下分析质控平台。派真生物的质控平台覆盖了分子生物、细胞免疫、理化控制、微生物、高通量测序、质谱表征等多个技术平台。其中，派真生物率先开发了特有的 rcAAV PackRich 技术，能够在低至 10 IU 的阳性对照病毒下仍然能检出，同时重现性和稳健性更高。我们对目前 CDE 指南中提出的”相同血清型或衣壳类型的阳性对照病毒可能在感染特性方面更具有代表性”，自建了可复制型病毒阳性对照的制备平台，能够根据客户血清型进行阳性病毒的定制化生产。此外，派真生物还通过优化感染滴度（TCID50）测试方法，提高了方法的可重复性、稳定性。
AAV 载体的结构表征是基因治疗质量研究的核心，派真生物采用先进的分析技术，深入研究 AAV 的关键特性，采用 AUC（分析超速离心法）精确测定空壳、部分包装衣壳、全壳比例，确保产品均一性。在衣壳蛋白表征方面，利用液谱联用（HPLC MS）技术，评估衣壳蛋白的组分和翻译后修饰（PTMs）。在基因组异质性方面，通过毛细管电泳、多维 ddPCR、三代测序等方法评估 AAV 基因组的完整性。
其次是体系建设方面，派真注重内部检测标准的建立的同时积极参与行业和国家标准的制定。我们参与了国内 4 个国家标准品的建设，也积极参与了中检院主导的行业指南《基因治疗制品质量控制概述》的起草。在标准物质和菌毒种方面，我们建立了多个血清型的实心标准品、空壳标准品、可复制阳性 AAV 标准品、辅助病毒、检定细胞株等多种标准物质和检定用菌毒种。这些标准物质的使用使得检测的稳健可靠得到了保障。在质量体系建设方面，我们注重与国际接轨。派真生物密切关注国际标准和行业规范（如 FDA、ICH、USP、Ph. Eur.），并依据这些标准建立了全面的质量管理体系。通过中国厂区与美国厂区在质量体系上的合作，我们实现了全球适用性体系的搭建。
最后是派真持续加大质量研究领域的投入，不断开发新技术以满足未来更高的质量控制要求。通过专注于在 AAV 载体的质量控制中获得了头部的优势，使得我们的数据积累量大大提升，从而进一步提升了我们平台的认知。这些平台的认知能够更好地服务我们的客户，为客户提供专业的咨询建议。
总而言之，派真生物在质量研究和质量控制方面持续努力，就是为了应对基因治疗制品的质量挑战，推动中国基因治疗行业质量标准的全面提升。
丁香园：在派真生物的国际化进程中，您认为哪些因素是成功的关键？对于未来，您希望派真生物在基因治疗领域扮演怎样的角色？
李华鹏：客观讲，企业的成功是动态的。只能说，在派真生物的国际化进程中，技术创新、全球市场拓展、产学研合作以及积极参与行业标准制定都是我们能取得目前成绩的关键因素。未来，我们依然会致力于成为基因治疗领域的技术创新引领者、高效平台提供者、社会责任承担者以及合作伙伴的赋能者，以确保基因治疗产品的安全性、有效性，并推动其在全球范围内的普及和可及性。
李华鹏博士本科毕业于中山大学，获得中国科学院广州生物医药与健康研究院细胞生物学博士学位后，在美国麻省大学医学院基因治疗中心从事博士后工作六年，专注于基因载体研究十余年，2014 年，创立派真生物，派真生物是一家专注于重组腺相关病毒（AAV）载体包装的 CRO & CTDMO 科技公司, 为细胞与基因治疗 (CGT) 企业的重组 AAV 载体药物的早期研发、临床前开发、临床试验以及药物审批，提供快速、经济、高质量、规模化的一站式 CMC 解决方案。自 2014 年成立以来，作为 AAV 载体 CRO 服务领域的引领者，派真生物已经为 20 多个国家的客户提供上万批次的 AAV 定制样品，客户涵括全球顶级跨国制药公司与各类研究机构。在 CTDMO 服务领域，派真生物基于包括 π-Alpha293 细胞 AAV 高产平台和 π-Omega 质粒高产平台在内的五大技术平台，以完整的质量和分析体系，为药企 AAV 与质粒的 GMP 规模化生产需求提供合规服务