常见问题

血清型选择：对于体外培养的细胞，AAV-DJ 和 AAV6 是最常用的血清型。在常规细胞培养条件下，AAV-DJ 的感染效率可超过 80%，而 AAV6 对血液来源细胞具有最强的感染能力。

感染梯度设定：rAAV 所驱动的转基因表达水平在不同基因之间可能存在显著差异。因此，在正式实验前，建议进行 3–4 个梯度剂量的 AAV 感染，以筛选出每种 rAAV 的最佳表达水平，并确认实验剂量不会对细胞造成毒性。

检测时间：通常在感染后 2–7 天进行。

血清型选择：如果您不确定哪种 AAV 血清型最适合您的实验，我们建议使用携带荧光报告基因的 rAAV，在您的实验体系中测试 3 种或以上不同血清型的感染效率，以筛选出最适合的类型。

感染梯度设定：rAAV 所驱动的转基因表达水平在不同基因之间可能存在较大差异。因此，在正式实验前，建议进行 3–4 个梯度剂量的 AAV 感染，以确定每种 rAAV 的最佳表达水平。

实验对照设置：建议使用与实验载体具有相同血清型和启动子的 GFP 阳性对照病毒，作为实验对照。

作为一种高效的外源基因递送工具，rAAV 正被越来越多的研究人员应用于体内实验。然而，不同实验目的和研究领域对注射部位、rAAV 用量、rAAV 浓度及作用时间的要求可能存在显著差异。因此，目前尚难以制定一套适用于所有实验的通用 AAV 注射方案。客户需根据自身的具体研究目标，分别探索并优化上述各项参数。

与其他病毒载体相比，AAV（腺相关病毒）因其安全性高、免疫原性低、能够转导非分裂细胞，并可在不整合入宿主基因组的前提下实现长期基因表达而具有显著优势。这些特点使其在需要长期表达且对安全性要求极高的基因治疗领域尤为具有吸引力。

不过，AAV 的一个局限是其包装容量有限，不适合递送较大的基因。相比之下，腺病毒和单纯疱疹病毒（HSV）等载体虽然具备更大的基因承载能力，但免疫原性较高，存在更多安全性风险。慢病毒和逆转录病毒载体虽然可通过基因组整合实现稳定的长期表达，但也伴随着插入突变等潜在风险。

AAV 还具备通过不同血清型实现组织特异性靶向的能力，并具有良好的安全性，可用于构建多种遗传疾病的治疗方案，从而最大程度降低治疗风险。正因如此，AAV 载体在科研和临床基因治疗项目中正日益受到青睐。

截至目前，已发现 9 种自然存在的人源 AAV 血清型（AAV1/2/3/4/5/6/7/8/9），并被广泛应用于科学研究中。2004 年，在非人灵长类动物中首次发现了 AAV10 和 AAV11，并证实其与 AAV2 之间无交叉反应性，使其成为具有潜力的候选载体。随后，研究人员又从猿类腺病毒中分离出 AAV12 和 AAV13，目前相关研究仍较有限。在这些天然型 AAV 的基础上，研究人员通过多种改造策略开发出多个 AAV 突变型，如 AAV-DJ 和 PHP 系列。

由于不同 AAV 血清型的衣壳蛋白空间结构不同，其与细胞表面受体的识别与结合能力存在显著差异，从而导致其在组织趋向性（tropism）上的显著不同。因此，在选择血清型时，可以参考同行评审文献中的实验应用。例如，在脑部研究中，AAV1 和 AAV9 的使用频率明显高于其他天然型 AAV，而 AAV6 对淋巴细胞具有更强的选择性。

此外，还有许多人工设计的工程型血清型，通过改造衣壳蛋白以提升其在基因治疗中的性能。这些改造可能包括：改变组织趋向性、提高转导效率、降低免疫原性或增强载体的基因包装能力。此类工程型血清型通常通过定向进化、理性设计或不同血清型杂交等策略开发而成，具备更高的应用灵活性与性能表现，是靶向基因递送的有力工具，广泛应用于生物医学研究和治疗开发中。

派真生物提供近 100 种血清型的包装服务，以满足不同研究需求。

同时，开发具备更强组织特异性与更高感染能力的 AAV 突变型是 AAV 基因递送创新的重要方向。派真生物也提供全面的 AAV 血清型工程服务，为您提供一站式解决方案。

但需要注意的是，即使天然型 AAV 存在一定的组织趋向性，也无法完全避免对非靶向组织的感染。在此情况下，结合组织或细胞特异性启动子与合适的血清型，可显著增强 AAV 的特异性。派真生物提供多种组织特异性启动子，如肌肉特异性启动子 MHCK7-2 和肝脏特异性启动子 TBG669。我们在线订购系统中集成的 piVector Design 工具提供多种启动子选项，包括通用型和组织特异性启动子，您可便捷地将目标序列构建至我们已验证的 AAV 载体骨架中，确保后续病毒包装的高效性与稳定性。

常用的空壳率检测方法包括 分析型超速离心（AUC）、透射电子显微镜（TEM）、冷冻电镜（CryoTEM）以及 基因组滴度与衣壳滴度比值法（VG TITER/CAPSID TITER）。然而，AUC、TEM 和 CryoTEM 并不适合作为放行质控方法，它们更适用于质量研究与工艺开发。目前，我们主要采用阴离子交换色谱 HPLC进行相关方法开发。派真生物可提供空壳率分析方法开发服务，并可通过 CryoTEM 和 AUC 检测结果进行方法验证。

不同血清型通过层析纯化后的空壳率存在差异。针对研究级与 NHP 级产品，我们对多数常见血清型可通过 TEM 检测保证空壳率低于 30% 或 20%。对于 GMP 级生产，我们将在工艺开发阶段对空壳率进行检测。例如，派真生物的 AAV9 生产工艺可通过优化控制空壳率维持在10% 以下。

派真生物采用碘克沙醇密度梯度离心联合多步过滤与无菌处理流程，制备高纯度的 AAV 产品。

我们提供的 AAV 质量控制（QC）检测项目将依据您选择的 AAV 等级而有所不同，详细的 QC 项目对比请参阅我们的 AAV 分析服务页面。

以下是部分 QC 检测项目：

① 纯度检测：
研究级 AAV 采用 SDS-PAGE 联合考马斯亮蓝染色评估纯度，NHP 级 AAV 则采用银染方式评估蛋白纯度。

② 滴度检测：
研究级与 HT 级 AAV 使用 ATCC 标准品校准，并通过 SYBR Green qPCR 进行滴度检测，滴度可达 1E+13 GC/mL 或更高；NHP 级 AAV 使用 ddPCR 进行滴度检测，采用针对 5′ 与 3′ ITR 区的特异性引物。

③ 内毒素检测：
研究级 AAV 内毒素限值为 ≤10 EU/mL，NHP 级 AAV 为 ≤1 EU/mL。如有更高要求，可根据需求提供更严格标准（需另行收费）。

④ 透射电子显微镜（TEM，选配）：
通过电镜观察空/满壳比例，大多数常见血清型在研究级中空壳率低于 30%，NHP 级中低于 20%。

⑤ HPLC 纯度分析（选配）：
我们提供 AEC-HPLC（阴离子交换色谱）与 SEC-HPLC（分子筛色谱）方法：

• AEC-HPLC 适用于检测 AAV 与宿主蛋白、核酸等杂质的分离与纯度评估。

• SEC-HPLC 依据颗粒大小分离样本中的病毒、聚集体或片段颗粒，评估粒径分布与纯度。

⑥ 质谱分析（选配）：

• HPLC-MS/MS 进行 AAV 衣壳蛋白肽段图谱分析（Capsid Peptide Mapping）以判定血清型。

• RP-HPLC-MS 进行衣壳蛋白分子量与比例检测（Capsid Protein MW & Ratio）。

⑦ ddPCR 滴度检测（选配）：
相较 qPCR，ddPCR 在灵敏度、准确性与重现性方面表现更优。

如需了解更多补充检测服务，欢迎访问我们的 AAV 分析服务页面获取详细信息。

GC 表示基因组拷贝数，GC/ml 表示每毫升病毒溶液中所含的总基因组拷贝数。派真生物采用 SYBR Green 荧光定量 PCR 方法检测 AAV 滴度，并使用 ATCC 标准品进行校准。PCR 引物设计针对 ITR 区域。派真生物提供的大多数血清型病毒的滴度均高于 1E+13 GC/ml。GC/ml 本质上指的是每毫升病毒溶液中所含的总基因拷贝数。常用的检测方法包括 dot-blot、QC-PCR 和实时定量 PCR。样品在检测前通常会经过 DNase I 处理，因此该滴度通常指的是处理后每毫升病毒溶液中所剩余的基因拷贝总数。