慢病毒（Lentivirus）因其可感染分裂与非分裂细胞、外源基因稳定整合、表达持久等优势，被广泛应用于基因过表达、基因敲低/敲除、细胞治疗及功能基因组学研究。
一、三质粒系统的组成与功能
第三代慢病毒三质粒系统通常由以下三部分构成：
1. 转移载体质粒（Transfer Vector）
- 含目的基因（GOI）、启动子（如 CMV、EF1α、PGK、组织特异性启动子）
- 包含 LTR、Ψ（包装信号）、RRE 等顺式作用元件
- 可搭载荧光蛋白（GFP、mCherry）或筛选标记（Puro、Neo）
作用：决定最终病毒递送与表达的基因信息。
2. 包装质粒（Packaging Plasmid，如 psPAX2）
- 提供 Gag / Pol / Rev 等病毒结构与复制相关蛋白
- 不含包装信号 Ψ，无法被自身包装
作用：提供病毒颗粒组装和复制所需蛋白，但不参与基因转移。
3. 包膜质粒（Envelope Plasmid，如 pMD2.G）
- 通常编码 VSV‑G 蛋白
作用：决定病毒的宿主范围与感染效率，使慢病毒具备广泛嗜性和较高稳定性。
二、三质粒系统的标准包装流程
1. 细胞准备
- 常用包装细胞：HEK293T / HEK293FT
- 细胞状态：
- 生长旺盛、无污染
- 转染当天融合度约 70–80%
2. 质粒比例与转染根据实验规模准备合适量的转移质粒、包装质粒、和包膜质粒。
以适当的比例混合这三种质粒。
转染方式：
- PEI（科研中最常用、成本低）
- Lipofectamine 2000 / 3000
- 钙磷法（对操作要求较高）
关键点：
- 使用高纯度、低内毒素质粒
- 转染体系保持一致性，避免批次差异
3. 病毒收集与处理
- 首次收毒：转染后 48 h
- 第二次收毒：72 h
- 收集上清后 0.45 μm 过滤去除细胞碎片
如需高滴度：
- PEG 沉淀
- 超速离心
- 商业浓缩试剂
三、操作中的关键影响因素
1. 病毒滴度相关因素
- 转移载体插入片段大小（>5 kb 会显著降低滴度）
- 启动子强度与毒性
- 转染效率与细胞状态
2. 安全性控制
- 三质粒系统将 复制与包装功能分离，降低复制型病毒（RCL）风险
- 实验需在 BSL‑2 条件下操作
- 病毒废液需规范灭活（含氯消毒或高压灭菌）
3. 病毒保存
- 短期：4℃ ≤ 24 h（不推荐）
- 长期：−80℃ 分装保存，避免反复冻融
