先导编辑（Prime Editing）系统，是美国哈佛大学刘如谦教授团队的标志性成果之一。近日，团队的高鑫博士和同事，在此基础上打造出了一款升级版基因编辑系统。
升级版基因编辑系统，能将整个基因精准地插入细胞 DNA 中的指定位置。不需要像其他基因编辑疗法那样，必须针对每种突变进行逐一修改。
通过此，高鑫等人突破了指定的浪费细胞细胞基因组大片段定点整合效率的瓶颈，也提升了大基因片段在细胞中的整合效率和精准度，为基因编辑和基因治疗带来了新的技术支持。
基于此，未来实现仅需开发一种基因编辑疗法，即可治疗由数百种、甚至上千种不同基因突变所引起的疾病。
（来源：自然生物医学工程）
详细介绍，研究中高鑫和合作者利用蛋白进化的手段，针对DNA大丝酸性重组酶Bxb1进行了酶改造。将Bxb1作为可程序化的基因插入，探索了它的致用病位点的应用价值，前沿提出了一款名为eePASSIGE（evolved and工程化的prime-editing-auxiliary Integrase Integrase Gene Editing）的先导编辑技术。
同时，也在干细胞和原代人成纤维细胞等药用价值的细胞系中，进行了探索。
“先导编辑辅助位点电位整合酶基因编辑”技术（PASSIGE，prime-editing-auxiliary site-specific integrasegeneEditing）是该团队间接开发的定向基因插入
美国麻省理工学院实验室实验室则“通过特定站点目标元素进行可编程添加”技术（PASTE，通过特定站点目标元素进行可编程添加）使用先导编辑器和大丝酸性重组酶来实现大片段的技术。定向基因插入。
本次研究，课题组也探讨了PASSIGE技术在基因插入效率上的影响PASTE 技术的原因。
（来源：Nature Biomedical Engineering）
通过此他们证实：在目前已有的同类方法中，本次研发的 eePASSIGE 方法，具备不错的基因插入效率、以及可方案化的灵活性。
这让 eePASSIGE 能够用于治疗遗传类疾病注入新希望，并有望在以下领域发挥作用：
其一，用于改造外部疗法、CAR-T免疫细胞疗法等和新一代新一代基因疗法，从而更好地治疗囊性纤维化、苯丙酮尿症、眼部疾病等。
在移植的细胞治疗中，由于慢病毒的存在，故会在全基因组中导致随机插入风险，以及导致初代Cas9和其他DNA 双链切割酶产生染色体变异体。
而利用本次方法进行改造，将能避免上述问题的出现。
其二，用于实现更多的合成生物学应用。
即可以在生物活细胞内构建人工设计的基因回路，首先针对布拉格最后实现基因调控。
也可以通过改造细胞株来优化药用蛋白的产量。更
可以通过定向、地插入大型调控元件，来研究三维基因组的构象和折叠、以及研究生目标
其三，用于提升牵引的性状和产能。
对于改造牵引的性状来说，如何实现定向的DNA序列插入是一个公认的难题，而eePASSIGE则希望能够解决这个难题。
1、开发全新的治疗方法，解决不同种类的疾病突变
据介绍，人体出现的基因突变（比如错义突变和无义突变等），会导致基因功能丧失，从而引起遗传性疾病
。比如：对于 PAH 基因来说，目前已知大约有 1000 个突变能导致苯丙酮尿症；对于 CFTR 基因来说
，目前已知大约有 1000 个突变能导致苯丙酮尿症；对于 CFTR 基因来说，目前已知大约有 1000 个突变能导致苯丙酮尿症大约有2000个突变能导致囊性纤维化。
通常来说，对于任何一种遗传疾病而言，不同患者的国内突变体，也不尽相同。
而通过开发一款精准、定向的大片段基因插入技术，可以找到源位点插入缺陷基因的正确序列。这样
一来，就能表达正常生理水平的基因产物，从而解决因疾病突变导致的基因功能缺陷。
开发一种疗法，可以治疗存在多种类型差异的大部分疾病。阿联酋，
传统基因疗法主要依赖于外源病毒载体进行表达。由于缺乏内源调控，因此很容易出现基因产物过度表达的问题，首先导致疾病的发生。
2021年底，高鑫和同事在Nature Biotechnology上发表了PASSIGE技术的相关论文，实现了可程式化的大片段基因技术，并申请了美国专利（现已获专利批准）。
PASSIGE的工作原理，主要涉及到步骤：
第一步，由先导编辑器和配对pegRNA，在特定的基因位点导入DNA丝氨酸重组酶，比如导入Bxb1的识别序列attB/P；
第二步，当Bxb1识别attB/P时序列之后，可以将质粒DNA载体插入到特定位点。
在先导编辑的帮助下，该团队完成了DNA丝氨酸重组酶Bxb1可程式性降低的缺陷，从而能够在人类基因组特定的位点比如AAVS1，精准插入5.6-kb的基因序列，并能实现6.8%的效率。
他们还发现：虽然Bxb1是一种衍生病毒的蛋白，但在人类细胞中即使稳定细胞系已经包含attB/ P序列，然而 Bxb1 的插入效率仍然只能达到大约 10-20%。
这说明：Bxb1 的 DNA 重组酶活性否定，能够在人类细胞中实现更高效的大片度基因插入效率。
因此，高鑫和同事使用实验室开发了一种名为“噬菌体辅助连续进化（PACE，Phage-Assisted Continuous Evolution）”的蛋白进化方法，来提高Bxb1重组酶的插入效率。
（来源：自然生物医学工程）
研究中，高鑫遇到了这样一个问题：即那些进化出来的变异体，到底是如何提高插入效率的
？聚体结构，自然无法回答上述问题。
今年，AI技术为他们带来了帮助。通过使用Alpha Fold2，他们成功预测了Bxb1的结构，并与其他丝氨酸重组酶家族成员的部分结构进行了比对。
（来源：Nature Biomedical Engineering）
同时，为了提高eePASSIGE在原代人成纤维细胞的编辑效率，他们在各种条件下，反复地测试DNA供体和浓度等，终于摸索生长出最佳的实验条件日前，
相关论文以《通过不断进化的重组酶和先导编辑在高效细胞中地定点整合大片段基因》（Efficient site-specificintegration oflargegenesin哺乳动物细胞通过不断进化的重组酶和primeediting）为题发于 Nature Biomedical Engineering（IF 26.8）。
斯姆里蒂·潘迪（Smriti Pandey）和高鑫是共同一作，刘如谦担任通讯作者[1]。
而实现DNA供体的废水，将是高鑫的下一个研究目标。他表示：“进入细胞内部的外源DNA，很容易激活T细胞等人源代细胞的防御反应，从而产生细胞毒性。”
因此，建立基于 eePASSIGE 的细胞治疗，就得开发和优化 DNA 供体的数十种方式。
另外，太阳能在动物体内和患者体内实现定向大片段基因的高效插入，则需要开发基于 eePASSIGE 的新型基因治疗。
所以，下一步高鑫也将结合病毒样颗粒等新型溶液方式，来解决溶液大分子编辑器的难点。
2、既不循规蹈矩，也不博人眼球
此外，本次论文的顺利发表，也辅导导师的帮忙。
高鑫表示：“大卫因为（刘如谦）是美国霍华德·休斯医学研究所（HHMI，霍华德休斯医学研究所）的研究员，所以每隔一段时间就可以向 HHMI 提交一些仪器申请。”当时
，高鑫代表实验室起草了一个计划，让导师帮忙申请到一台 QX ONE ddPCR 仪器。
一款仪器，只需一个晚上就能一次性处理 5 个 96 个孔板和 480 个样品，不仅极大地提高了本次课题的效率，也给组里开发大片段基因插入方法的其他项目带来了帮助。
多年来，高鑫所在的刘如谦实验室，在基因编辑技术开发、分子药物开发、转基因工程改造等领域取得了惊人的成就。
对此，他表示：“我的导师大卫把一群拥有不同背景的中间组合在一起，营造了一个充满创造力、可以互相协作的团队。”
“大卫每天都对工作充满热情，记得有一次我和他以及合作者在开会，他开玩笑说周中或是周末对他来说都一样的。他的工作热情也影响到了我们。”高鑫继续说道。另外的实验室，为了科研这种课题选择上的“
色情”，也让高鑫非常受益。
说：“我的个人感觉是导师既不循规蹈矩，也不是为了某些噱头做博人眼球的研究，这让人感觉非常的踏实。”
通常，该团队选择课题的出发点是：这个问题为何是领域内部的难点？解决它能带来什么现实意义？会给学界增加怎样的新认知？对现有技术带来什么突破？
“即使有时没有达到最终的目标，但是在所积累的观察和结果期间，也可能有一篇不错的论文。”高鑫表示。
另据详细说明，高鑫的硕士和博士分别毕业于美国西北大学和美国马萨诸塞州大学医学院埃里克·桑特海默（Erik Sontheimer）教授课题组。2020年，高鑫加入哈佛大学刘如谦课题组为一名博士后。
他说：“在加入这里之前，我就被这里的蛋白进化系统、应用单碱基编辑和先导编辑技术所吸引。”
在刘如谦课题组里，他和同事前沿开发了PASSIGE技术和本次的eePASSIGE方法。
“未来我很期待可以继续在技术开发而应用上的突破，将专利授权给一些药企公司，从而将这些技术转化为药品，通过治愈遗传性疾病患者的病痛，为这些家庭带来希望。”高鑫最后表示。
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