CAR-T细胞疗法作为一种革命性的治疗方式，已在多种血液系统肿瘤和实体瘤治疗中展现出显著疗效。然而，传统的CAR-T制备方法存在一些局限性：
- 随机整合风险：目前批准的产品都依赖逆转录病毒或慢病毒的半随机整合，可能导致插入性突变和继发性恶性肿瘤的风险；
- 功能不均一：随机整合位点导致CAR表达水平不一致，影响治疗效果；
- T细胞耗竭：传统方法制备的CAR-T细胞更容易出现耗竭标志物。
为了解决这些问题，科学家们开发了T细胞受体α链恒定区（T cell receptor alpha constant, TRAC）位点定向整合技术：利用CRISPR-Cas9在TRAC位点产生双链断裂，使用AAV载体或裸单链DNA（ssDNA）递送的CAR作为同源修复模板，实现CAR基因在TRAC位点的精准敲入。这种方法的优势在于：
- 表达均一：所有修饰细胞的CAR表达都由相同的内源性TCR启动子驱动；
- 功能增强：生成的CAR-T细胞功能更加均一；
- 耗竭减少：与传统逆转录病毒方法相比，T细胞耗竭标志物显著降低。
虽然TRAC位点定向整合技术前景广阔，但大部分研究都使用了AAV6载体来递送CAR。关键问题是：AAV6真的是T细胞基因编辑的最佳选择吗？
近期，来自澳大利亚悉尼大学的研究团队在《Molecular Therapy》杂志上发表了一项研究结果，通过开发TRAC-HR定向进化平台，成功筛选出两种新型AAV衣壳变体（AAV-T1和AAV-T2），它们在原代T细胞中的靶向基因编辑效率比传统AAV6高5倍，感染的T细胞在脑肿瘤细胞系中表现出更高的细胞毒性。
一、TRAC-HR平台
什么是TRAC-HR?
简单来说，TRAC-HR是一种革命性的AAV载体筛选系统，专为挑选能高效进行基因编辑的AAV载体而设计。它的名称中，”TRAC”指T细胞受体α恒定区基因座，”HR”则代表同源重组修复（Homologous Recombination）。
想象一下，传统筛选方法就像在大海中漫无目的地捞鱼，而TRAC-HR则是在海中精准投放了智能捕鱼网，专门捕获最优质的”鱼”——那些不仅能进入细胞，还能有效支持CRISPR-Cas9基因编辑的AAV变体。
TRAC-HR的工作原理是什么？
TRAC-HR的工作原理可以概括成精准筛选的“三步法“。
第一步：预选优质“选手“。面对数百万种可能的AAV变体（想象成数百万名应聘者），首先使用”功能转导(FT)平台”进行初筛，淘汰无法转导T细胞的变体。这一步就像简历筛选，迅速将候选人从数百万减少到数万，剔除那些完全无法转导目标细胞的变体。
第二步：精准评估实战能力。这一步是TRAC-HR平台的核心创新点，将初筛的优质“选手”转入TRAC-HR平台，进一步筛选支持基因编辑的变体。它不仅看AAV能否进入细胞，还要看它能否支持CRISPR-Cas9介导的基因敲入——这就像不仅测评应聘者能否到达工作地点，更要测试他们是否能完成核心任务。
第三步：多重验证，锁定精英。最后阶段，研究人员将表现最佳的变体进行高通量验证，并在多个供体的T细胞中测试，确保选出的AAV变体具有广泛适用性。
二、AAV-T1/T2的诞生过程
01 预筛选：先确定潜力骨架，再进行深度优化
传统AAV筛选往往从随机文库开始，但TRAC-HR平台采用了更加务实的方法：先找出有潜力的”种子选手”，再进行深度优化。研究人员首先对62种已知的AAV血清型进行了转导效率测试，筛选出在T细胞中转导效率较高的血清型，将可能的骨架从62种减少到AAV2、AAV6和AAV4这3种。
派真生物可提供上百种AAV血清型和变体，助力潜力骨架筛选。
02 双轨并行的文库设计策略
基于预筛选结果，研究人员设计了两种互补性的文库类型：
1)肽展示文库：局部优化策略
选择了预筛选中表现最佳的AAV2和AAV6作为骨架，在衣壳蛋白表面特定位点插入随机7肽序列，同时对7肽的编码序列进行了优化，使用了NNK7和VNS7两种简并密码子设计，避免了单一模板可能带来的偏倚，生成了约10⁹个不同的变体。这种设计的优势在于：保留原有骨架优势，通过表面修饰提高靶向性和功能。
2) DNA重排文库：全局优化策略
利用预筛选中表现优异的AAV4和AAV6，将两种血清型的衣壳基因片段进行DNA家族重组，生成约10⁶个嵌合变体。这种设计的优势在于：通过结构域交换创造全新特性，实现跨越式创新。
派真生物可提供随机多肽插入、DNA重排等多种文库设计服务。
03 筛选过程和结果
第一轮，通过使用FT平台进行初筛，将AAV2肽展示文库从约500万种变体缩减至1.1-1.5万种，AAV6肽展示文库缩减至2–2.5万种。
第二轮，将从mRNA中回收的衣壳基因分别克隆至TRAC-HR平台和FT平台，在三份不同供体来源的T细胞中进行并行筛选。
第三轮，分别合成AAV2与AAV6文库中第二轮FT和HR筛选排名前200的变体，共400种变体，在四份不同供体来源的T细胞中进行筛选，进一步评估两种筛选方法是否富集到相同的新型AAV变体（图1）。
图1.TRAC-HR筛选平台与筛选流程示意图。(a)第一轮筛选：在FT平台（3名T细胞供体）中进行；第二轮筛选：同时在FT平台和HR平台中进行（3名T细胞供体）。(b)最后一轮筛选及不同筛选方法严格性的同步验证：根据AAV2和AAV6肽库在FT-RNA与HR筛选中的NGS结果，合成并构建了一个包含200个最优AAV2变体与200个最优AAV6变体的混合文库（均来自FT-RNA和HR筛选），并将该文库分别克隆到FT和HR两个平台中进行验证。
FT平台的RNA回收数据显示，基于AAV2与AAV6的文库表现相当，其中新型载体AAV6.P20表现最强。相反，在HDR筛选中，基于AAV6的文库显著优于基于AAV2的文库，表现最佳的新型变体为AAV6.P05。这一结果表明：擅长基因表达的AAV变体与擅长基因编辑的AAV变体并不完全一致，表达优秀≠编辑优秀。
04 新进化和理性设计衣壳的功能验证
验证对象：AAV2肽插入文库中的9个衣壳+ AAV6肽插入文库中的14个衣壳+重组文库中的16个变体，此外，研究团队还利用已发表的衣壳基因信息，采用理性设计策略生成了具有嵌合VP1/2和包含VR-VIII肽插入位点的AAV6-VP3的新型衣壳变体。在对这些新型变体进行初步测试后，研究团队最终选择了23个最有前景的候选变体，其中包括4个AAV6肽变体、4个AAV4/6嵌合体、8个带肽插入的嵌合体，以及7个带肽插入和三重突变的嵌合体。
验证方法：首轮验证采用了条形码技术，同时评估了上述AAV变体在三个关键层面的表现。
- 细胞进入能力：多数新型变体表现优于或等同于AAV6，其中AAV6.P05、AAV4/6.15.P05（以下简称AAV-T2）、AAV4/6.15.P05.TM等变体在细胞附着/进入方面显著提升；
- 核转位效率：AAV6.P05和AAV-T2等变体显著提升；
- 基因表达水平：AAV6.P04和AAV4/6.15.P01（以下简称AAV-T1）等变体脱颖而出（图2）。
图2. 新型AAV衣壳在T细胞中的载体入胞、核转运、转基因表达及同源定向修复（HDR）效能评估。(A)产生图(B)数据的实验流程。(B)新型衣壳在总DNA、核DNA及转基因表达水平上的表现。(C)产生图(D)与(E)数据的实验流程。(D)代表性散点图显示在无或有25种衣壳AAV Kit 的情况下，RNP或mock电穿孔后TCRα与GFP的表达情况。(E)新型衣壳在HDR水平上的表现。总剂量：2,000 vg/cell；各衣壳剂量：80 vg/cell。所有结果均以AAV6为基准进行归一化，展示来自4位供体T细胞实验的中位值。
有趣的是，研究发现载体在细胞进入和基因表达方面的表现并不完全一致，提示不同步骤可能存在独立的优化潜力（图3）。
图3. 新型AAV衣壳在T细胞中的细胞进入和转基因表达的头对头比较。(A)产生所示数据的实验流程。(B)以所示剂量感染T细胞后，新型衣壳的载体拷贝数分析。(C)代表性散点图显示在缺乏或存在指定AAV衣壳变体时的CD3与GFP表达情况。(D)以1,000 vg/cell剂量感染后，eGFP⁺/CD3⁺双阳性T细胞的百分比。(E)以1,000 vg/cell剂量感染后，存活T细胞中eGFP的平均荧光强度。(F)以200 vg/cell剂量感染后，eGFP⁺/CD3⁺双阳性T细胞的百分比。(G)以200 vg/cell剂量感染后，存活T细胞中eGFP的平均荧光强度。
第二轮验证评估了上述AAV变体在T细胞基因编辑中的实际表现。通过使用TRAC同源臂包围的条形码eGFP表达盒以及严格对照证实eGFP表达确实来自靶向整合事件，发现AAV6.P05、AAV-T2等变体在靶向整合方面显著优于AAV6。
在最后的并行验证实验中，研究者发现携带P01肽的AAV4/5.16变体表现优于携带P05肽的AAV4/5.16变体，这与NGS结果相反。揭示了高通量筛选与实际应用间可能存在的差异。
进一步实验表明，与AAV6相比，AAV.P01、AAV-T1、AAV-T2和AAV4/6.16.P01介导的P2A-eGFP表达盒靶向敲入显著改善（图4），尽管某些变体（如含P05肽的变体AAV-T2）在基因表达方面可能不如传统载体，但它们在基因编辑应用中却表现出色，进一步证实了为特定应用目的开发专门优化的载体的重要性。
图4. 新型AAV衣壳在T细胞中同源定向修复（HDR）效能的头对头比较。(A)产生所示数据的实验流程。(B)代表性散点图显示在RNP或mock电穿孔后，在缺乏或存在AAV-T1的情况下，TCRα与GFP的表达情况。(C)以1,000 vg/cell剂量的指定AAV变体感染后，eGFP⁺/TCRα⁻ T 细胞的百分比。所有结果均来自6位供体T细胞的独立实验数据。
派真生物可提供各种条形码表达盒，助力AAV变体的高通量筛选。
三、AAV-T1/T2的优异性能
在CAR-T细胞的制备中，AAV-T1和T2仅需极低剂量即可高效完成靶向整合，且副作用更低，性能远胜传统AAV6。
1. 载体效率提升
HDR效率（同源重组介导的CAR基因敲入）：AAV-T1 和 AAV-T2 在TRAC基因座的靶向整合效率比传统 AAV6 提高 5倍。在 1,000 vg/cell 剂量下，AAV-T1/T2的敲入效率接近甚至超过 AAV6在5,000 vg/cell 的表现（图5C）。
病毒剂量降低：仅需 1/5剂量（1,000 vg/cell vs. 5,000 vg/cell）即可达到相同的CAR-T生成效率，显著降低病毒用量和潜在副作用。
2. 抗肿瘤活性
在弥漫内生性脑桥胶质瘤细胞（脑干胶质瘤模型）杀伤实验中，AAV-T1/T2生成的CAR-T细胞在 1,000 vg/cell 剂量下的肿瘤杀伤速度（KT50，半数杀伤时间）与 AAV6在5,000 vg/cell 相当（图6E、F）。
3. 转录组安全性
AAV-T1/T2处理的CAR-T细胞转录组扰动更小（仅0-1个显著差异基因），而AAV6组有7个基因显著改变（如CTLA4上调提示T细胞耗竭）。
4. 不依赖电穿孔的适用性
在无电穿孔条件下（使用A5K肽递送Cas9-RNP），AAV-T1仍比AAV6提升5倍HDR效率，AAV-T2也有1.5-2.5倍改善（图5C），证明其可兼容新型非电转系统。
图5. 肽介导的Cas9/sgRNA递送实现T细胞无需电穿孔的体外基因编辑。(A)生成所示数据的实验流程。(B)散点图示例：显示在无电穿孔条件下，经肽-RNP或空白处理（mock）孵育后，T细胞中TCRα和GFP的表达情况；图中同时标注了是否加入AAV-T1。(C)在不同剂量AAV载体处理后，T细胞中eGFP阳性且TCRα阴性的百分比。所有结果均来自5位供体T细胞的独立实验。
图6. 新型AAV衣壳在功能性CAR-T制备及肿瘤细胞杀伤方面优于AAV6。(A)同源臂侧翼的嵌合抗原受体（CAR）构建示意图，以及生成图(B)和(C)所示数据的实验流程。(B)代表性散点图：展示在有无RNP电穿孔或空白处理（mock）条件下，以及是否加入AAV-T1时，T细胞中TCRα和EGFR的表达情况。(C)在不同剂量AAV载体处理后，T细胞中EGFR阳性且TCRα阴性的百分比。结果来自6位供体T细胞的独立实验。(D)细胞溶解实验：利用xCelligence系统检测不同处理T细胞存在下，贴壁DIPG细胞的数量，生成图(E)和(F)所示数据。(E)细胞溶解百分比（以表达eGFP且TCRα阴性的T细胞处理条件下的细胞存活率为基准进行归一化）。结果展示6位供体T细胞独立实验的中位值。(F)从T细胞处理开始至达到50%细胞溶解所需的时间（KT50），对应不同AAV载体剂量及衣壳变体。结果来自6位供体T细胞的独立实验，柱状图显示中位值。
四、AAV-T1/T2将如何改变CAR-T产品的开发
总结与展望
AAV‑T1/T2的出现，为通用型CAR‑T带来了“更高效率+更低剂量+更好活性”的三赢局面。 如果您正在：
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参考资料：
Westhaus, A., et al. (2025). Tailoring capsid-directed evolution technology for improved AAV-mediated CAR-T generation. Molecular Therapy, 33(6), 2801-2820. https://doi.org/10.1016/j.ymthe.2024.12.012.
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