AAV滴度不够的原因有哪些?

AAV（腺相关病毒）制备过程中滴度不足是比较常见的问题，通常是多环节因素叠加的结果。

1. 质粒与转染相关

• 质粒质量差：含内毒素或降解，导致转染效率低。

• 质粒比例不合理：AAV 三质粒/双质粒系统中（Rep/Cap、Helper、转录载体），比例失衡影响装配效率。

• 转染效率低：DNA 浓度不足、转染试剂失效、操作不规范。

2. 生产细胞状态

• 细胞密度不合适：过低转染效率差，过高则细胞代谢压力大。

• 细胞健康状况差：污染（支原体、细菌）、过度传代或营养不足都会降低产量。

• 细胞系差异：HEK293T、HEK293、HEK293FT 等，不同系产量差异大。

3. 包装与培养条件

• 收获时间不当：转染后 48–72h 是常见最佳时间，过早颗粒未形成，过晚颗粒降解。

• 培养基成分问题：血清质量差或成分变化影响病毒装配。

• 裂解方法不充分：AAV 主要在细胞内，若裂解不彻底（冻融不够、酶解不足），释放率低。

4. 外源基因因素

• 转基因过大：AAV 最大包装容量约 4.7 kb，超过会显著降低滴度。

• 基因有毒性：对宿主细胞有害，细胞提前死亡。

• 序列结构异常：重复序列、GC 含量过高可能影响复制和装配。

5. 下游纯化与保存

• 纯化损失：碘克沙醇梯度、层析柱纯化过程中可能导致颗粒流失。

• 保存条件差：反复冻融或长时间 4℃ 保存会降低功能滴度。

• 过滤损失：0.22 μm 滤膜可能吸附一部分颗粒。

6. 滴度检测相关

• 检测方法差异：qPCR（基因组滴度）、ELISA（衣壳滴度）、功能滴度检测结果差异大。

• 操作误差：细胞状态不佳、稀释错误等，都会使结果偏低。

7. 优化方向

• 使用高纯度、无内毒素质粒，优化转染体系。

• 保持细胞健康、密度合适。

• 把握合适收获时间，采用高效裂解方法。

• 控制外源基因大小与毒性。

• 优化纯化工艺，减少病毒损失。

• 根据研究目的选择合适的滴度检测方法。