AAV包装常见问题、原因

AAV（腺相关病毒）包装过程中确实可能会遇到不少问题，这很常见。下面我帮你梳理一些常见问题、可能的原因以及应对思路。

一、常见问题及原因

1. 病毒滴度低

• 可能原因：

  • 转染效率低（HEK293T 状态差、细胞密度不合适、转染试剂问题）。

  • Rep/Cap 或 Helper 质粒质量差（降解、浓度不准）。

  • 转移载体 ITR 区域突变或重组 → 无法有效复制包装。

  • 载体过大（AAV 最大包装能力约 4.7 kb，超过会严重降低滴度）。

  • 收获时间不当（通常 48–72h 收获最佳）。

2. 细胞状态不好（死亡/不贴壁）

• 可能原因：

  • 转染量过大，DNA 和转染试剂对细胞有毒性。

  • 辅助质粒表达的腺病毒蛋白对细胞有应激作用。

  • HEK293T 传代次数过多，已丧失高效转染/包装能力。

3. 杂质多、纯化效果差

• 可能原因：

  • 细胞裂解不彻底 → 释放不均匀。

  • 裂解方法过粗暴（如反复冻融）→ 导致病毒颗粒破坏。

  • 纯化步骤不当（PEG 沉淀残留、碘克沙醇梯度操作不规范）。

  • 未充分去除细胞碎片和蛋白 → 后续感染有毒性。

4. 感染效率低（尽管滴度高）

• 可能原因：

  • Cap 蛋白血清型不匹配目标细胞或组织。

  • 宿主细胞缺乏 AAV 受体或辅助因子。

  • 病毒在冻融过程中部分失活。

  • 病毒未纯化彻底 → 实际感染单位被杂质“稀释”。

5. 转基因表达低或无表达

• 可能原因：

  • 启动子不合适（例如用 CMV 在神经元中容易沉默）。

  • GOI 插入方向或框架错误。

  • ITR 损坏或不完整 → 载体无法正确转录。

  • 过量病毒触发宿主细胞防御反应 → 表达被抑制。

二、排查与优化建议

1. 细胞准备

   • 使用健康的 HEK293T（低传代，状态良好，密度 60–80%）。

   • 转染前更换新鲜培养基。

2. 质粒质量

   • 确保质粒浓度足，无内毒素。

   • 特别注意 ITR 区域：容易重组丢失，需要做 SmaI/BssHII 酶切检测。

3. 转染优化

   • 不要一次性加入过多 DNA/试剂。

   • 调整转染比。

4. 收获和纯化

   • 通常在 60–72 小时收获病毒。

   • 选择合适的纯化方式（PEG 浓缩、CsCl 或 Iodixanol 梯度、柱层析）。

5. 应用相关

   • 根据实验需求选择合适的 血清型（Cap）。

   • 如果基因较大，可考虑 split AAV 系统。

   • 体内应用需检测内毒素，保证制剂纯度。

AAV 包装过程中常见问题主要集中在 转染效率、质粒完整性、载体容量、纯化方法和 Cap 血清型选择。逐步排查这些环节，往往就能找到滴度低或感染效率不佳的原因。