AAV在生殖系统疾病研究中的应用策略

2025年11月6日

据估计，全球约15%的夫妇面临不孕不育问题，其中相当比例与遗传性生殖系统功能障碍相关。传统治疗手段（激素替代、辅助生殖技术）主要针对症状管理，而基因治疗有望从分子水平纠正致病机制。腺相关病毒（AAV）因其低免疫原性、长期表达特性和极低的基因组整合风险（<1%），已成为生殖系统基因递送的优选载体。

一、AAV生殖系统基因递送策略

在生殖系统疾病研究中，AAV的应用效果离不开三个关键选择：血清型、启动子和注射方式。不同组合的搭配，直接决定了基因递送的效率和特异性。

1. 血清型的选择

AAV的血清型由衣壳蛋白决定，不同血清型对生殖系统细胞的亲和力差异显著。

AAVDJ：对睾丸细胞转导效率高。在Lhcgr基因缺陷小鼠模型中，AAVDJ对睾丸间质祖细胞的转导效率远超传统的AAV8(图1)。此外，AAVDJ也可以穿透透明带,高效感染体外培养的受精卵[1]。

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图1 AAVDJ对睾丸细胞显示出最高的转染效率。 (A) 野生型小鼠睾丸在分别注射表达mCherry的不同衣壳（1、2、5、6、7、7m8、8、9、rh10、anc80和DJ）的AAV后7天的宏观外观，剂量分别为8×10⁸、8×10⁹和8×10¹⁰gc/睾丸。(B-C) 向 Lhcgr^-/- 小鼠睾丸分别递增剂量注射 AAVDJ-mCherry（8×10⁸、8×10⁹ 和 8×10¹⁰ gc/睾丸）或 AAV8-mCherry（8×10¹⁰ gc/睾丸）后，睾丸切片的代表性共聚焦图像。注射后 7 天收取睾丸组织，并用 Leydig 祖细胞标志物（PDGFRα、Nestin）进行免疫染色（n=3）。(C-D) 病毒转导率 = mCherry⁺ 细胞数 ÷ PDGFRα⁺ 或 Nestin⁺ Leydig 祖细胞数。(E-G) 注射 AAVDJ-mCherry（8×10¹⁰ gc/睾丸）后 7 天，对睾丸进行免疫染色，分别标记生殖细胞标志物 DDX4（F）、巨噬细胞标志物 AIF1（G）以及管周肌样细胞标志物 α-SMA（H）（n=3）。细胞核用 DAPI 复染[2]。

AAV9：生殖系统中的广谱血清型。在卵巢中，AAV9能穿透卵巢间质和卵泡基底膜，感染颗粒细胞(图2) ；在睾丸中，将AAV9显微注射到生精小管后，病毒能够穿透基底膜和血睾屏障(BTB)，转导支持细胞、精原干细胞（SSCs）、管周细胞和间质细胞（图3）。

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图2 不同血清型AAV对小鼠卵巢的感染效率。（A）显微注射到小鼠卵巢中。注射后7天，在紫外灯下观察卵巢，所有注射的卵巢均出现荧光信号，但强度不一。（B）AAV9在颗粒细胞中的信号最强[3]。

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图3 不同AAV血清型对小鼠睾丸的感染效果。(A) 注射途径示意图。(B) 显微注射表达mCherry的AAV后1周，野生型小鼠睾丸的宏观外观。(C) 注射AAV1、AAV8或AAV9-mCherry后1周，对睾丸进行免疫染色，检测未分化精原细胞（GFRA1）和支持细胞（WT1）标志物。箭头指示被AAV感染的目标细胞。(D) 免疫染色定量分析。从3个不同睾丸中各选取3条小管，分别统计小管内和小管间注射的效果。(E) 注射AAV1或AAV9-mCherry后1周，对睾丸进行STAR或ACTA2免疫染色。箭头指示被AAV感染的目标细胞[4]。

AAV6：胚胎基因递送的优选血清型。研究发现，AAV6能够通过扩散方式跨越透明带，无需显微注射即可实现对着床前胚胎的高效转导，简化了胚胎基因递送操作流程。此外，向怀孕母鼠输卵管腔注射AAV6，可有效转导被透明带包裹的着床前胚胎（图4）。

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图4 rAAV-1、-2、-5 和 -6 对小鼠胚胎及输卵管的嗜性。(A) 实验流程示意图。B6C3F1雌鼠先经孕马血清促性腺激素（PMSG）和人绒毛膜促性腺激素（hCG）超排处理，次日与雄鼠合笼，早晨检查阴道栓。见栓者视为怀孕，于妊娠第0.7天（晚合子期）接受AAV-GONAD操作。至第2.4天，取桑葚胚和输卵管进行EGFP荧光观察。(B) 采用 scAAV-CAG-EGFP-1、-2、-5 和 -6 在 B6C3F1 孕鼠进行 AAV-GONAD 后 2 天，观察桑葚胚（a–c、e–g、i–k、m–o）和输卵管（d、h、l、p）的荧光。Bright：白光照片；EGFP：蓝光激发照片；Merge：白光与蓝光叠加。 (C) 不同血清型 rAAV 处理后的单个桑葚胚 GFP 表达定量。Kruskal–Wallis 检验结合 Dunn 多重比较显示，scAAV-CAG-EGFP-6 组与对照组差异显著（**p < 0.005）。(D) 单个桑葚胚平均 GFP 表达水平与对应输卵管表达水平的相关性分析。胚胎与输卵管上皮转导效率呈中等程度相关（Pearson 相关系数 r = 0.5217，p < 0.0001）。红色线为拟合直线[5]。

其它血清型：AAV1在睾丸支持细胞和精原干细胞中具有一定转导能力[4],在受精卵和胚胎也具有较高的转导能力[1]；AAV8虽能靶向睾丸间质细胞，但效率低于AAVDJ和AAV9。

表1 生殖系统疾病研究常用的AAV血清型总结

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2. 启动子：让基因在“正确的细胞”中表达

启动子是决定基因表达特异性的“开关”，特异性启动子可以实现基因在特定组织或细胞中高效特异性表达。虽然已有部分组织特异性启动子可用（如Amh、Star启动子），但其表达强度通常弱于广谱启动子。因此，结合局部注射与强启动子（CAG、EF1α、CMV等）仍是AAV在生殖系统研究中目前最有效的策略。

3. 注射方式和剂量

生殖系统具有复杂的结构屏障，如睾丸的血-睾屏障，卵巢的间质和卵泡基底膜，传统的全身给药难以让AAV到达目标细胞。因此，局部精准注射是生殖系统AAV应用的关键。

常用的注射方式包括：

睾丸局部注射：睾丸间质注射(图5)，直接将AAV注射到睾丸间质空间，适用于靶向间质细胞（如治疗睾酮缺乏症）。例如，在Lhcgr缺陷小鼠模型中，通过间质注射AAVDJ-Lhcgr，能快速恢复间质细胞功能，提升睾酮水平[2]。生精小管注射，通过输出小管将AAV注入生精小管内，可靶向支持细胞(图6)。

图5 小鼠睾丸间质注射示意图[6]。

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图6 小鼠生精小管注射。对已麻醉小鼠开腹，切口位于包皮腺正上方（A）。显露睾丸后，将其与腹部脂肪垫分离（B）。在双目镜下找到并剔除附睾脂肪，将微注射针置于附睾管旁，针尖朝向输出小管（C）。把玻璃毛细管插入输出小管，并顺势推进至睾丸，使其尖端直达睾丸网（D）。借助 Fast Green 实时监测 DNA 注入及生精小管充盈情况[7]。

卵巢局部注射：卵巢间质注射，适用于靶向颗粒细胞和卵泡膜细胞（图7）。

图7 卵巢显微注射示意图[4，8]。

输卵管原位注射：在妊娠早期，将AAV注入输卵管lumen，可实现早期胚胎的原位感染，避免了胚胎体外操作的复杂流程，提高了基因治疗的效率[5]。

宫腔内注射：将AAV直接注入子宫腔内,该方式可使病毒精准作用于子宫内膜组织 [9]。

表2 不同注射方式的作用区域和AAV参考剂量（以小鼠为例）

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二、典型应用案例

1. 雄性不育的基因治疗

Lhcgr 基因缺陷是导致男性间质细胞功能衰竭（LCF）的重要原因，患者表现为睾酮缺乏、生精障碍和不育。传统的睾酮替代治疗会抑制下丘脑-垂体-性腺轴，进一步加重不育。

发表在《Cell Proliferation》杂志上面的一篇文章“AAV-mediated gene therapy restores natural fertility and improves physical function in the Lhcgr-deficient mouse model of Leydig cell failure”中，研究团队构建了 AAVDJ-Lhcgr 载体，通过睾丸间质注射给药。结果显示，治疗后小鼠血清睾酮水平达到野生型小鼠的60%（图8）；生精小管直径显著增大，精子数量和活力恢复至正常水平，且精子能正常受精； 80%的治疗小鼠能通过自然交配产生健康后代，且后代基因组中未检测到AAV整合，证明了其安全性[2]。

图8 AAVDJ-Lhcgr可恢复Lhcgr敲除小鼠中的Lhcgr表达和睾酮水平[2]。

2. 先天性不孕的基因治疗

Kitl 基因缺陷是导致雌性小鼠卵巢颗粒细胞功能异常无法分泌Kitl蛋白、血-卵泡屏障（BFB）下卵泡发育停滞的关键原因，表现为卵巢微小、原始卵泡无法发育、雌激素水平低下及完全不育，目前尚无有效治疗手段改善这一先天性不孕问题。发表在《Cell Reports Medicine》杂志上的文章 “Adeno-associated-virus-mediated gene delivery to ovaries restores fertility in congenital infertile mice” 中，研究团队构建了AAV9-Kitl（核心治疗载体）、AAV9-mCherry（报告载体）等多种AAV载体，通过卵巢间质显微注射给药（部分实验联合神经氨酸酶增强转导效率）。结果显示， AAV9可高效穿透BFB，仅感染AMH⁺颗粒细胞而不损伤卵母细胞，转导效率较其他血清型（如AAV1、AAV7M8）提升30%以上；卵泡发育重启，Kitl缺陷小鼠治疗后卵巢体积显著增大，次级卵泡数量增加，卵泡从原始阶段发育至具有多层颗粒细胞的成熟阶段；激素水平改善，自然生育恢复，42.1%（8/19）的治疗小鼠通过自然交配产生健康后代，最早62天获得首胎，平均每窝3.1只幼崽；安全性得到验证，后代基因组经Southern blot和PCR检测无AAV整合，H19、Igf2r基因印记模式正常，无遗传风险（图9）。

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图9 AAV9-Kitl 感染挽救 Kitl ^SI-t/Kitl ^SI-t突变小鼠的不育。(A) 与 (B) 注射 AAV9-Kitl 后 Kitl ^SI-t/Kitl ^SI-t小鼠卵巢的外观 (A) 与组织学 (B)；箭头示生长中的卵母细胞。(C) 具有两层颗粒细胞的卵泡计数 (n = 8 个卵巢)。(D) AAV9-Kitl 注射后出生的子代。(E) AAV9-Kitl 感染后 Kitl ^SI-t/Kitl ^SI-t突变小鼠外周血激素水平[3]。

3. 生殖系统肿瘤的基因治疗

前列腺癌是男性常见恶性肿瘤，其进展常伴随抑癌基因maspin的下调，导致肿瘤细胞凋亡抑制、血管生成增加，传统治疗（如雄激素剥夺疗法）响应期有限且易复发，急需新型高效治疗手段。

发表在《Human Gene Therapy》杂志上的文章 “Adeno-Associated Virus 2-Mediated Intratumoral Prostate Cancer Gene Therapy: Long-Term Maspin Expression Efficiently Suppresses Tumor Growth” 中，研究团队构建了AAV2-maspin、AAV2-LacZ（对照）、AAV2-GFP（报告）三种AAV2载体，通过裸鼠前列腺癌移植瘤瘤内注射给药（每肿瘤注射 1×10¹⁰GC病毒，100μL）。结果显示，maspin表达持续且高效，AAV2-maspin治疗组肿瘤内maspin蛋白在注射后10天可检测到，28天达峰值并维持至56天，部分肿瘤112天仍有表达；肿瘤细胞凋亡显著增强，LNCaP和DU145移植瘤中凋亡细胞数量是 AAV2-LacZ组的3-10倍，maspin阳性细胞中凋亡比例显著高于GFP阳性细胞；血管生成被有效抑制，治疗组肿瘤CD31阳性微血管密度较对照组降低40%以上；肿瘤生长与存活改善，LNCaP和DU145移植瘤体积显著小于对照，15% LNCaP肿瘤、8% DU145肿瘤完全消失，治疗组小鼠存活期较对照组延长约45-60天，且无明显毒性，证明了其有效性与安全性（图10）。

图10 AAV2-maspin在前列腺癌小鼠模型中抑制肿瘤生长，延长荷瘤小鼠的生存期[10]。

三、总结与展望

从恢复小鼠的自然生育能力，到抑制生殖系统肿瘤生长，AAV以其独特的优势，在生殖系统基因治疗领域展现出巨大潜力。随着血清型改造、启动子优化和注射技术的不断进步，我们有理由相信，AAV可以为更多不孕不育患者和生殖系统疾病患者带来希望，推动生殖健康领域进入“精准基因治疗时代”。

派真生物拥有完整的AAV载体研发与生产技术平台，可为您提供从载体设计、衣壳工程、质粒构建到病毒包装的一站式服务，助力生殖系统疾病研究。

参考资料

[1] Romeo C, et al. AAV diffuses across zona pellucida for effortless gene delivery to fertilized eggs. Biochem Biophys Res Commun. 2020;526:85-90.

[2] Zhang S, et al. AAV-mediated gene therapy restores natural fertility and improves physical function in the Lhcgr-deficient mouse model of Leydig cell failure. Cell Prolif. 2024;57:e13680.[3] Kanatsu-Shinohara M, et al.Adeno-associated-virus-mediated gene delivery to ovaries restores fertility in congenital infertile mice. Cell Rep Med. 2022;3:100606[4] Watanabe S, et al. In vivo genetic manipulation of spermatogonial stem cells and their microenvironment by adeno-associated viruses. Stem Cell Rep. 2018;10:1551-1564.

[5] Sato M, et al. Direct injection of recombinant AAV-containing solution into the oviductal lumen of pregnant mice caused in situ infection of both preimplantation embryos and oviductal epithelium. Int J Mol Sci. 2022;23:4897.

[6] Pang J, et al. Targeted gene silencing in mouse testicular Sertoli and Leydig cells using adeno-associated virus vectors .Asian Journal of Andrology. 2025; 27: 627–637.

[7] Michaelis M, Sobczak A, Weitzel JM. In vivo microinjection and electroporation of mouse testis. J Vis Exp. 2014 Aug 23;(90):51802.

[8] Cozzolino M, Ergun Y, Seli DA, Herraiz S. Intraovarian PRP injection improves oocyte quality and early embryo development in mouse models of chemotherapy-induced diminished ovarian reserve. Aging (Albany NY). 2024 Sep 13; 16:12123-12137 .

[9] Song M, Zhao G, Sun H, et al. circPTPN12/miR-21–5p/∆Np63α pathway contributes to human endometrial fibrosis. eLife. 2021;10:e65735.

[10] Watanabe M, et al. Adeno-associated virus 2-mediated intratumoral prostate cancer gene therapy: Long-term maspin expression efficiently suppresses tumor growth. Hum Gene Ther. 2005;16:699-710.

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