AAV病毒包装注意事项

一、细胞准备

1.推荐细胞系：HEK293T 或 AAV-293

• 要求细胞状态良好、无污染、无过度融合。

2.汇合度 70–85% 最佳

• 太低影响转染效率，太高影响病毒产量。

3.不可使用抗生素！

• 抗生素会影响转染效率和细胞状态。

4.培养基保持新鲜

• 建议转染前 2–4 小时更换新鲜培养基。

二、质粒相关注意事项

1.三质粒系统：Rep/Cap + Helper + GOI 载体（ITR）

• 保证 ITR 完整，否则无法包装。

2.质粒必须高纯、高质量（OD260/280 = 1.8–2.0）

• 内毒素含量低（<10 EU/μg）。

3.质粒比例精准配比

• 常用：1:1:1 或 1:1:2，根据试剂优化。

4.检查 Plasmid 尺寸

• AAV 最大可包装 ≤4.7 kb（含 ITR）。
• 超过会导致滴度显著下降。

三、转染步骤注意事项

• 选择高效转染试剂（PEI、Lipofectamine 3000 等）
• DNA 与转染试剂比例需优化
• 每平方厘米细胞用 DNA 量通常为 1–2 μg。
• 避免产生沉淀（PEI-DNA 若混合不当会出现白色沉淀）
• 转染 6–8 h 后可换液（减少毒性提升产量）

四、病毒表达期管理

1.收毒时间：48–72h（第一次），96h（第二次）

2.注意轻轻吸取病毒液

• 避免扰动细胞，减少杂质。

3.保持 37°C、5% CO₂ 稳定培养

4.确保无细菌、真菌、支原体污染

五、纯化过程注意事项

（适用于 CsCl、PEG、柱纯、梯度离心）

1.避免剪切 AAV 颗粒

• 操作轻柔，使用低蛋白吸附离心管（如 PP 管）。

2.使用无菌、去内毒素试剂及器材

3.建议加入 0.001–0.01% Pluronic F-68 防止黏附

4.梯度离心注意不要扰动病毒层

六、滴度测定注意事项

常用方法：qPCR / ddPCR / ELISA / SDS-PAGE

1.不得使用未经 RNase/DNase 处理的样品

2.保证标准品准确性

3.qPCR/ ddPCR 需使用 ITR 或 Cap 引物（视目的而定）

4.注意区分 vg 与 vp（基因组 vs. 衣壳）

七、病毒保存注意事项

1.不要冻融！

• AAV 冻融会造成滴度下降（10–30%）。

2.建议分装：−80°C 或 −20°C 长期保存

3.使用含 0.001–0.01% Pluronic 的 PBS / HBSS

4.避免玻璃管保存，病毒容易吸附损失

八、常见错误与避免方法