一般来说,AAV病毒样品反复冻融确实会增加衣壳蛋白(VP1/VP2/VP3)受损或破碎的风险,从而导致滴度下降、感染效率变差。
反复冻融对AAV衣壳的影响机制
| 影响因素 | 说明 |
| 冻融过程产生冰晶 | 冻结时形成的冰晶可对病毒颗粒造成物理性损伤,破坏衣壳结构。 |
| pH与离子浓度变化 | 缓冲液在冻结过程中可能局部浓缩或pH改变,使蛋白结构不稳定。 |
| 表面张力变化 | 冷冻-融解交替使病毒颗粒承受机械应力,增加衣壳断裂概率。 |
| 蛋白质本身易变性 | 蛋白衣壳重复应力后更易部分解聚或变性失活。 |
多数研究和实验室经验一致认为:AAV不建议冻融超过 1–2 次,超过 3 次可能显著降低感染滴度甚至部分颗粒破损。
冻融对实验结果的潜在影响
| 影响 | 表现 |
| 颗粒结构破坏 | ssDNA外露,衣壳破裂或松动 |
| 滴度下降 | qPCR测基因组滴度变化小,但感染滴度IFU/GC比明显降低 |
| 传递效率变差 | 动物实验、体外细胞感染效率下降 |
| 免疫学性质改变 | 衣壳完整性受损可能影响抗体结合及检测信号 |
注意:即使衣壳未完全破裂,功能滴度也可能显著下降。qPCR仅测基因组滴度,无法反映功能性损伤。
避免AAV冻融损伤的建议
| 操作 | 建议 |
| 分装储存 | 小体积Aliquot(如10–50 μL/管),避免重复冻融 |
| 存放温度 | 长期 −80℃,短期使用周期内可置于 −20℃ |
| 缓冲体系 | 推荐含 0.001–0.01% Pluronic F68 或 0.001% Tween-20 减少吸附与变性 |
| 使用时处理 | 取用前尽量低温快速融化,避免长时间室温暴露 |
反复冻融会增加AAV衣壳蛋白破碎风险,导致滴度与感染效率下降。建议一次冻融后尽快使用,并通过小量分装来避免损失。
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