提纯质粒dna过程中可能遇到哪些污染问题?

在质粒 DNA 提纯（尤其是碱裂解法）过程中，常见的污染问题主要来自细胞成分、试剂残留或操作不当。这些污染会直接影响转染效率、病毒包装（AAV / 慢病毒）、酶切、测序等下游实验。下面按污染类型 → 来源 → 影响 → 解决思路系统整理👇

一、RNA 污染（最常见）

来源

• RNase A 添加不足或失活

• 裂解后未充分降解 RNA

• 裂解时间过长，RNA 释放量过大

表现

• Nanodrop 上 260/280 正常，但电泳出现低分子拖尾

• 质粒“看起来很多”，但功能实验效果差

影响

• 干扰浓度测定

• 影响转染、病毒包装一致性

解决

• 确认 RNase A 新鲜、浓度足够

• 裂解后混匀充分，但不要剧烈震荡

• 必要时增加 RNase 处理步骤

二、基因组 DNA（gDNA）污染

来源

• 裂解或中和步骤操作粗暴（剧烈震荡、涡旋）

• 中和不充分，gDNA 未完全沉淀

• 菌体过量

表现

• 电泳出现高分子量条带或涂抹

• 质粒溶液粘稠、拉丝

影响

• 影响酶切、转染

• AAV / LV 包装时可能引入非特异 DNA

解决

• 裂解后轻柔颠倒混匀，严禁 vortex

• 中和液加入后立即轻柔混匀

• 控制菌量（不要贪多）

三、蛋白污染

来源

• 蛋白变性不充分

• 洗涤步骤不彻底

• 裂解液 / 中和液比例错误

表现

• 260/280 < 1.8

• 质粒颜色发黄或有沉淀

影响

• 抑制酶活性

• 影响转染和病毒包装效率

解决

• 确保洗涤液（含乙醇）用量和次数充足

• 洗柱后彻底离心去乙醇

• 必要时增加一次洗涤

四、内毒素（Endotoxin，科研 & 病毒包装重点）

来源

• 大肠杆菌细胞壁成分（LPS）

• 普通质粒提取试剂盒不去内毒素

表现

• Nanodrop 看起来“很完美”

• 但细胞转染后细胞死亡、应激、表达低

影响

• 显著降低哺乳动物细胞转染效率

• 严重影响 AAV / 慢病毒包装滴度

解决

• 用 Endo-free 质粒提取试剂盒

• 病毒包装、动物实验必须低内毒素

• 避免长时间放置裂解液

五、盐离子与洗脱试剂残留（NaCl / Guanidine / 乙醇）

成因

• 洗涤不充分

• 柱未彻底干燥

• 洗脱体积过小

表现

• NanoDrop 260/230 偏低（<2.0）

• DNA 不易溶解

• 转染效率下降

影响

• 抑制酶反应

• 影响细胞状态

规避

• 洗涤后空柱离心 1–2 min

• 确保乙醇完全挥发

• 使用无盐缓冲液洗脱

六、微生物 / 交叉污染

成因

• 操作台不洁

• 枪头重复使用

• 不同质粒混用

影响

• 序列错误

• 实验不可重复

规避

• 分区操作

• 使用滤芯枪头

• 批次清晰标记

八、快速自检对照表

指标	正常范围	可能污染
260/280 ≈ 1.8	正常	—
260/280 <1.7	蛋白	蛋白残留
260/280 >2.0	RNA	RNA 污染
260/230 <1.8	盐/乙醇	洗涤不充分
转染毒性高	—	内毒素

九、针对病毒包装（AAV / 慢病毒）的特别提醒

很多 AAV / LV 失败，本质不是包装问题，而是质粒污染问题

用于病毒包装的质粒必须满足：

• ✅ 高纯度

• ✅ 低内毒素

• ✅ 无 gDNA / RNA

• ✅ 结构完整（无降解）