腺相关病毒（AAV）因其安全性高、免疫原性低、适合长期稳定表达等特点，被广泛应用于体内和体外基因功能研究。在科研实验中，AAV 最常见的两种应用模式是基因敲降（knockdown）和基因过表达（overexpression）。本文将围绕两种策略的原理、设计要点及适用场景进行系统梳理。
一、AAV 介导的基因敲降（Knockdown）
1. 敲降的基本原理
AAV 介导的敲降通常基于 RNA 干扰（RNAi）机制，通过表达 shRNA 或人工 miRNA，使靶基因 mRNA 降解或翻译受抑，从而降低蛋白表达水平。
需要注意的是，AAV 介导的敲降属于部分抑制，并非完全敲除，敲降效率一般在 50%–80% 之间。
2. 常用敲降策略
（1）shRNA / miRNA 敲降
这是目前最成熟、应用最广的 AAV 敲降方式。
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shRNA 或人工 miRNA 序列由 AAV 在细胞内持续表达
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经加工后形成 siRNA，发挥敲降作用
相较传统 shRNA，基于 miRNA scaffold（如 miR-30）的设计在体内实验中毒性更低、表达更稳定，目前更为推荐。
（2）CRISPRi（dCas9 + sgRNA）
CRISPRi 利用失活 Cas9 抑制转录而不切割 DNA，具有可逆、特异性强的优点。但该体系元件较多，AAV 装载压力大，常需双 AAV 系统，更适合对调控精度要求较高的研究。
3. 启动子与调控方式选择
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U6 / H1 启动子：常用于驱动 shRNA 或 sgRNA
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组织或细胞特异启动子：用于限制敲降范围
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Cre-dependent（DIO/FLEX）系统：实现条件性敲降
二、AAV 介导的基因过表达（Overexpression）
1. 过表达的基本设计
AAV 过表达通常通过直接表达目的基因 cDNA，实现蛋白水平的显著提升。典型结构包括：启动子 – 目的基因（GOI）– polyA，可根据需要加入标签或报告基因。
2. 启动子选择原则
不同实验需求下，启动子的选择直接影响表达强度和特异性：
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CAG / CMV：强启动子，适合需要高表达的场景
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EF1α：表达相对温和、稳定
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hSyn / CamKIIα：神经元特异
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GFAP：星形胶质细胞特异
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DIO/FLEX：用于条件性过表达
3. AAV 过表达的关键限制
AAV 的最大装载容量约为 4.7 kb（含 ITR）。当插入片段接近或超过该限制时，往往会导致：
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病毒滴度下降
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空壳病毒比例升高
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表达不稳定或显著降低
此外，某些功能蛋白（如激酶、转录因子、信号通路核心调控因子）在过表达状态下可能引发非生理性表型，需谨慎评估。
三、敲降与过表达的应用场景比较
| 维度 | 基因敲降 | 基因过表达 |
| 调控强度 | 中等 | 强 |
| 生理相关性 | 较高 | 较低 |
| 假阳性风险 | 低 | 较高 |
| 表型显现 | 稳定 | 快速但需验证 |
| in vivo 安全性 | 较好 | 需谨慎 |
常见研究策略：先通过敲降观察表型，再进行过表达或 rescue 实验验证因果关系，是目前说服力较强的实验设计思路。
四、进阶应用设计
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AAV 介导的敲降 + 过表达 rescue
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Cre-lox 条件性敲降 / 过表达
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Tet-on / Tet-off 可诱导表达系统
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与 GFP、mCherry 等报告基因联用
五、实验中常见问题与经验总结
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病毒滴度高并不等同于表达效率高
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体外实验有效并不代表体内同样适用
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shRNA 的潜在毒性容易被低估
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超大基因不适合强行使用 AAV 递送
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