AAV 超速离心条带中常见杂质

在腺相关病毒（AAV）制备过程中，超速离心（CsCl 或 Iodixanol 梯度）是最常用的纯化手段之一。该方法基于颗粒密度差异对病毒进行分离，通常可在离心管中观察到清晰的条带。

需要注意的是，条带并不等同于“全部为有效 AAV 病毒”。在目标条带及其相邻区域中，往往还会存在多种非理想成分。

一、条带中最常见的杂质类型

1. 空壳 AAV（Empty capsid）

空壳 AAV 是超速离心条带中最常见的杂质。

其结构与完整 AAV 相同，仅由衣壳蛋白组成，但不含任何病毒基因组。由于密度略低，空壳通常与完整病毒形成相邻条带，甚至在部分体系中出现重叠。

空壳 AAV 的主要问题在于：

• 无法表达目的基因

• 占据感染位点，降低有效转导效率

• 在 in vivo 实验中可能增加免疫反应风险

2. 部分包装 AAV（Partial genome particles）

部分包装 AAV 指病毒中装载的是不完整或截短的基因组片段。

该类颗粒常见于：

• 转基因长度接近或超过 AAV 包装上限

• ITR 结构异常或发生重组

在检测中，这类病毒往往表现为：

• qPCR 滴度不低

• 实际功能表达明显偏低

因此，仅依赖滴度数据，容易高估病毒的实际有效性。

3. 错误包装 DNA（Mis-packaged DNA）

在 AAV 装配过程中，除目标基因组外，病毒衣壳偶尔会误包装其他 DNA 片段，包括：

• 质粒骨架序列

• 宿主细胞基因组 DNA

• helper plasmid 相关片段

这类杂质在密度上可能接近完整 AAV，难以仅通过条带位置区分。在体内实验或临床前研究中，错误包装 DNA 被认为存在潜在的生物安全风险。

二、非条带型但常伴随存在的杂质

4. 宿主细胞蛋白（HCP）

尽管经过超速离心纯化，仍可能残留少量宿主细胞蛋白。这些蛋白：

• 通常不形成清晰条带

• 可能吸附在 AAV 表面

残留 HCP 会影响病毒纯度，尤其在高要求应用场景中需要重点关注。

5. 游离核酸（DNA / RNA）

若细胞裂解或核酸酶处理不充分，游离核酸可能残留于样品中，导致：

• 梯度粘度升高

• 条带模糊或拖尾

• 滴度检测准确性下降

三、不同超速离心体系的条带分布特点

Iodixanol 梯度体系

• 15%–25%：蛋白碎片及轻杂质

• 25%–40%：以空壳 AAV 为主

• 40%–60% 交界处：主要为完整 AAV（目标条带）

• 60% 以下：重杂质或聚集体

CsCl 梯度体系

• 可更精细地区分空壳、部分包装及完整 AAV

• 但操作周期较长，且可能对病毒活性产生一定影响

四、AAV 条带质量的综合判断建议

在实际应用中，不建议仅凭条带是否清晰来判断 AAV 质量。更可靠的评估方式应结合：

• 病毒基因组滴度（vg）

• 衣壳总量或 vg/capsid 比值

• 体外转导或 in vivo 表达效果

总结

AAV 超速离心条带中最主要的杂质来源于空壳病毒和异常包装颗粒。条带只能反映颗粒密度分布，并不能直接代表病毒的功能有效性。只有结合定量检测与功能验证，才能全面评估 AAV 的真实质量。