AAV 长期存放后还能否继续使用？

AAV（腺相关病毒）因具有较好的物理化学稳定性，被广泛应用于基因治疗研究与递送开发中。因此，在实际研发过程中，AAV 样本常被默认视为“低温保存即可长期稳定”的材料。

但对于存放 1–2 年 的 AAV 样本而言，真正需要关注的风险，往往并不只是“是否降解”，而是其生物活性是否已经发生隐性丧失。

常规 qPCR 或 ddPCR 检测得到的 $vg/mL$，只能说明病毒基因组仍然存在；而实验能否获得稳定、可重复的转导结果，则取决于 AAV 从细胞进入、内体逃逸、入核到表达这一整条感染链路是否仍然完整。

因此，对于长期保存的 AAV 样本，仅依赖滴度判断是否可用，通常是不够的。本文从失效机制、关键检测项目与处理建议三个层面，对 AAV 长期存放后的复核思路进行系统整理，供研发与实验人员参考。

一、AAV 长期存放后的主要失效机制

AAV 的失效，通常并不首先表现为病毒 DNA 的明显降解，更常见的问题是衣壳结构与功能受损，从而导致感染效率下降或表达失败。

1. VP1 构象变化导致内体逃逸功能受损

AAV 衣壳由 VP1、VP2、VP3 组成，其中 VP1 的 N 端包含磷脂酶 A2（PLA2）结构域。该结构域在 AAV 感染过程中承担关键作用，尤其与内体逃逸（endosomal escape）密切相关。

在长期低温保存、反复冻融或温度变化较大的条件下，VP1 可能发生以下变化：

• 蛋白去折叠（unfolding）
• 构象遮蔽
• 异常暴露

其结果是：AAV 虽然仍可进入细胞，但无法有效从内体中释放，继而影响入核与后续表达。此类问题通常不会直接体现在 qPCR 滴度变化中，因此容易被忽视。

2. 管壁吸附与聚集造成隐性损耗

除构象变化外，AAV 在长期存储过程中还可能发生：

• 界面吸附（interface adsorption）
• 疏水驱动聚集（aggregation）

这类变化可能带来以下影响：

• 表观滴度下降
• 形成大颗粒复合体
• 细胞摄取效率降低
• 体内分布偏差增大

在普通耗材中，AAV 的吸附损耗通常更明显，因此建议在长期保存、分装及低浓度操作时，优先选择低吸附耗材，如 Protein LoBind 管，以减少非特异性损失。

二、长期存放 AAV 的四项关键复核实验

对于保存时间较长的 AAV 样本，建议至少从以下四个维度进行复核，以综合判断其是否仍适用于后续研究。

1. 滴度复核：qPCR / ddPCR

目的：确认病毒基因组是否完整，是否存在明显的 genome leakage 或结构性损伤。

操作建议：

• 优先设计针对 ITR 区域 的引物
• 同时检测 ITR 与 GOI（目的基因）
• 与原始批次记录进行对比分析

参考判定：

• 若滴度较原始记录下降 超过 0.5 log，应认为样本可能已发生明显损伤，需谨慎使用

需要注意的是，滴度检测只能说明“基因组是否仍在”，并不能代表“感染功能是否仍然完整”。

2. 聚集检测：DLS

动态光散射（DLS）是评估长期存放 AAV 样本状态的重要工具，尤其适用于判断是否存在聚集风险。

重点关注以下指标：

（1）平均粒径（Z-average）

• 正常 AAV 粒径一般约为 25–30 nm
• 若平均粒径 大于 40 nm，通常提示存在聚集

（2）PDI（多分散指数）

• < 0.15：理想
• 0.15–0.25：可接受
• > 0.3：需警惕
• > 0.4：通常不建议继续使用

（3）强度分布（Intensity PSD）

即使平均粒径处于正常范围，也应重点观察主峰右侧是否出现 100–500 nm 的弱峰。
若存在此类信号，即便占比很低，也提示样本中可能已形成不可逆聚集体。

常见误区：平均粒径正常，并不等于样本状态正常。实际判断时，应结合 PDI 与强度分布综合分析。

3. 功能验证：评估“是否还能用”的核心实验

在所有复核项目中，体外功能验证是最直接、最关键的一步。因为它能够真正回答：该 AAV 样本是否仍具备有效转导能力。

推荐细胞模型：

• AAV2 / AAV5 / AAV8：HEK293T（建议不超过 20 代）
• AAV9 / AAV-DJ：推荐 Huh7 或 AAVR 过表达细胞

注：AAV9 在 HEK293T 上的转导效率通常偏低，如需提高分辨率，可根据实验体系考虑加入低剂量 Etoposide 辅助评估。

MOI 建议：

建议至少覆盖 3 个梯度，例如：

• 1×10⁴vg/cell
• 5×10⁴vg/cell
• 1×10⁵ vg/cell

检测时间建议：

• CMV 启动子：约 48 h
• hSyn / CAG 启动子：约 72 h

读数方式：

优先采用流式细胞术（Flow Cytometry），记录：

• 阳性细胞比例（%）
• MFI（平均荧光强度）

建议判定方式：

可定义相对活性为：