广东轻工职业技术学院王国华团队联合南方医科大学等团队在 Journal of Biotechnology 期刊发表了题为：Deleting specific residues from the HNH linkers creates a CRISPR-SpCas9 variant with high fidelity and efficiency 的研究论文。
该研究提出了ED假说：不同的能量可以引起结构域不同的位移，能量越大，位移越大;并利用该假说首次通过调整spCas9的一个剪切结构域HNH的连接链，设计出了可以在保持高效的在靶剪切效率的同时大幅度降低了脱靶率的高精度高效率spCas9变体——Variant No.1。该研究进一步丰富了高精度基因编辑变体库，并为这类蛋白的优化设计提供了新方案。
成簇的规则间隔短回文重复序列(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats，CRISPR)及其相关(CRISPR-Cas)蛋白是细菌和古菌的免疫系统，其中来自酿脓链球菌的CRISPR-spCas9被深入研究和广泛应用于基因编辑。然而spCas9存在脱靶效应较高、体积较大、效率较低等缺点，尤其脱靶效应是影响其基因编辑临床应用的关键因素。
SpCas9剪切DNA是由REC3结构域和sgRNA/DNA杂合双链之间的相互作用启动，并最终引起HNH结构域向靶标位移实施剪切。在野生型spCas9中，当sgRNA和DNA完全配对成功时，促使HNH结构域向杂合双链位移的力量明显超出了实际需求，所以才会在出现错配的情况下依然启动剪切，即脱靶。
该研究提出了ED假说：不同的能量可以引起结构域不同的位移，能量越大，位移越大。而HNH结构域的位移的力量起始于REC3结构域向杂合双链的位移，因而该研究试图通过缩短REC3结构域或HNH结构域的连接链，将REC3结构域和HNH结构域拉离杂合双链，实现在错配时不能启动剪切的目标(策略一)。基于策略一，该研究设计了Variant No.1- Variant No.6.
表1：设计的变体及其突变位点
此外，鉴于提升sgRNA的guide序列的刚性可以降低脱靶率，该研究尝试延长guide序列周围的螺旋以期增强spCas9蛋白和guide序列之间的相互作用，通过进一步固定guide序列来增大DNA和guide序列的配对难度来减少错配脱靶(策略二)。基于策略二该研究设计了Variant No.7- Variant No.10.
图1：基于结构指导的变体设计
该研究通过ddPCR、T7EI对设计的变体的实际效果进行了验证，首先使用EMX1-1及其脱靶位点EMX1-1-OT1和EMX1-1-OT2对设计的变体进行筛选，结果表明Variant No.1、variant No.2、和variant No.5可以在EMX1-1位点上保持高效的在靶剪切效率的同时，大幅度降低在已知脱靶位点EMX1-1-OT1和EMX1-1-OT2脱靶率。尤其是Variant No.1将脱靶率降低到了野生型spCas9的4.0%的同时，保持了野生型 95.4%的在靶剪切效率(图2)。
图2：Variant No.1、Variant No.2和Variant No.5可以保持强劲在靶剪切的同时大幅降低脱靶
紧接着，该研究对Variant No.1、Variant No.2和Variant No.5在EMX1-2、FANCF-1、FANCF-3、VEGFA-5等位点的情况进行了测试，结果表明Variant No.1在以上位点均可以在保持强劲在靶剪切效率的同时大幅度降低脱靶率(图3)。
图3：对Variant No.1、Variant No.2和Variant No.5的扩展测验
鉴于Variant No.1的出色表现，该研究重新在HNH的两条连接链上删除两个丙氨酸设计Variant No.11.但结果表明Variant No.11几乎丧失剪切能力(表1、图4)。
图4：Variant No.11几乎丧失剪切能力
该研究将Variant No.1与国际上两个知名的spCas9变体进行了比较，表明Variant No.1可以在保持高效在靶剪切率的同时，大幅度降低脱靶效率，尤其是在在靶剪切效率方面的表现较为突出。
综上所述，该研究成功开发出了可以保持高效的在靶剪切效率的同时大幅度降低脱靶率的基因编辑工具spCas9的优秀变体Variant No.1.
论文链接
https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S0168165623000809