aav 质粒变成 aav 病毒的过程

AAV 质粒变成 AAV 病毒颗粒，本质上是一个体外人工包装过程，并不是质粒“自己变成”病毒，而是在包装细胞中被组装成病毒。标准流程如下（以常见的 三质粒系统 为例）：

一、所需质粒组成

通常需要 3 种质粒共同作用：

1.AAV 表达质粒（转基因质粒 / transfer plasmid）

• 含 ITR（倒置末端重复序列）
• 中间是目的基因表达框（启动子 + GOI + polyA）最终被包装进病毒的只有这一部分

2.Rep/Cap 辅助质粒

• 提供 Rep 蛋白：负责识别 ITR、复制基因组
• 提供 Cap 蛋白：形成 AAV 衣壳（决定血清型）

3.Helper 质粒（腺病毒辅助基因）

• 提供 E2A、E4、VA RNA 等
• 模拟腺病毒感染环境，但不产生腺病毒

二、质粒 → 病毒的核心步骤

1.共转染包装细胞（通常是 HEK293 / 293T）

• 将 3 种质粒按比例转染进细胞

• 常用方法：PEI / 脂质体转染

• 细胞提供转录、翻译和组装环境

2.AAV 基因组复制

• Rep 蛋白识别表达质粒两端的 ITR

• 启动目的基因表达框的复制

• 形成可被包装的 ssDNA AAV 基因组

3.衣壳蛋白表达与组装

• Cap 基因表达 VP1 / VP2 / VP3

• 在细胞核内自组装成 空衣壳

4.基因组装入衣壳（封装）

• Rep 蛋白介导

• 含 ITR 的 AAV 基因组被 选择性装入衣壳

• 形成 完整 AAV 病毒颗粒

5.病毒释放

• AAV 多数 存在于细胞内

• 通过 冻融 / 裂解 / 酶消化释放病毒

• 部分血清型（如 AAV2、AAV5）上清中也有病毒

6.纯化与质控

• 纯化：碘克沙醇梯度 / 柱层析

• 检测：

  • 基因组滴度（qPCR / ddPCR）

  • 空壳率

  • 内毒素、无菌、支原体等

三、关键要点总结

• 只有带 ITR 的表达盒会进入 AAV 病毒

• Rep/Cap 和 Helper 质粒 不会被包装

• 这是一个 体外重组 AAV 生产过程

• 最终得到的是 不复制、低免疫原性的重组 AAV