腺相关病毒(AAV)作为一种有效的基因传递工具，在基因治疗和基因编辑领域发挥着越来越重要的作用。构建适用于AAV载体的质粒是基因传递研究的关键一步。本文综述了AAV质粒构建的常用方法及其在基因治疗和基因编辑中的应用。
引言： AAV是一种非致病性的单链DNA病毒，具有较高的基因载荷能力和良好的细胞感染性，因而被广泛应用于基因治疗、基因转导和基因编辑研究中。AAV质粒的构建是AAV载体应用的首要步骤之一，其质量直接影响到后续基因传递的有效性和稳定性。
方法：
AAV质粒基本构建 AAV质粒通常包括基因的表达序列、AAV复制和包装所需的转录调控序列以及适当的选择标记。基因的表达序列通常选择受体细胞能够高效表达的启动子，如CMV启动子或CAG启动子。转录终止子和poly(A)序列可增强基因的稳定性和表达水平。此外，质粒中需要含有AAV复制和包装所需的ITR序列。选择标记如抗生素抗性基因或荧光蛋白基因则有助于筛选和追踪转染效率。
PCR扩增法构建 PCR扩增法是构建AAV质粒的一种快速、高效的方法。通过设计包含所需序列的引物，将基因序列扩增出来并连接至载体骨架上，最后进行转化筛选即可得到目的质粒。PCR扩增法不仅适用于构建全长基因质粒，也可用于构建基于AAV的短片段表达质粒。
限制性内切酶切割法构建 限制性内切酶切割法是传统的质粒构建方法之一。通过选择适当的内切酶对载体和目的基因进行酶切，然后进行连接和修饰，最终获得所需的AAV质粒。此方法操作简单，但对于较大片段的基因需要进行多次连接反应。
应用： AAV质粒的构建不仅可以用于基因治疗领域，还可以应用于基因编辑、基因表达调控等方面。在基因治疗中，通过构建携带特定基因的AAV载体，可实现对遗传病、肿瘤等疾病的基因疗法。在基因编辑中，AAV质粒可用于载体介导的CRISPR/Cas9系统，实现基因的精准编辑和修复。
结论： AAV质粒构建是基因传递研究的重要一环，不同的构建方法适用于不同的研究需求。随着基因治疗和基因编辑技术的不断发展，AAV质粒构建的方法也在不断创新和完善，为基因传递研究提供了强有力的工具和支持。