质粒抽提(Plasmid DNA extraction or plasmid isolation)是实验室中非常常见的分子生物学技术,其目的是从细菌细胞中提取并纯化质粒DNA。常用的几种质粒抽提方法如下:
碱裂法(Alkaline Lysis):
碱裂法是最常使用的一种方法,通常包括以下几个步骤:
收集含有目标质粒的细菌细胞,通过离心分离。
用含有NaOH和洗涤剂的裂解缓冲液破坏细菌细胞,释放质粒DNA。
向裂解液中加入酸性溶液(如醋酸)使pH值降低,这时细背的染色体DNA和蛋白质会沉淀,而质粒DNA则保持在溶液中。
离心以去除沉淀物,收集含有质粒DNA的上清液。
通过乙醇沉淀或柱层析的方式进一步净化质粒DNA。
沸水溶裂法(Boiling Lysis):
该方法较为简单,可用于快速筛选实验:
细菌涂抹在含有抗性基因的琼脂板上,孵化过夜。
将单个细菌落悬浮于水中,将混悬液加热至沸腾一段时间,以裂解细菌。
冷却并离心,收集上清液,其中包含小量的质粒DNA。
Kit 方法:
使用商业试剂盒进行质粒抽提是方便快捷的选择。试剂盒通常设计成简单的几步操作流程,有些还利用特殊的离子交换树脂或硅胶柱来精细地从裂解液中净化质粒DNA。
PEG沉淀法:
通过聚乙二醇(PEG)来促进DNA的沉淀和净化。
离心法:
利用超速离心(如通过梯度离心)来区分质粒DNA与其他细胞成分,尤其是在大量的DNA准备时使用。
电泳方法:
通过琼脂糖凝胶电泳来分离质粒DNA,然后使用紫外光或染料标记截取含有质粒的凝胶区块,进一步提取纯化。
不同方法选择取决于实验需要、质粒大小、所需纯度、以及处理样品数量等因素。对于常规的质粒抽提,使用商业试剂盒是非常方便且高效的方法,特别是当需要较高纯度和较低背景的质粒时。