质粒提取和胶体电泳是基础分子生物学技能,初学者进行这些操作可能感到有些复杂。但是,通过遵循一系列步骤和一些基本要领,即使是科研新手也能成功地提取质粒以及分析电泳图谱。以下是一个简明的指导流程:
如何提取质粒
选择并培养宿主细胞
以大肠杆菌为例,取一环带有待提取质粒的菌株,在含有适当抗生素的LB液体培养基中过夜培养。
细胞收集和裂解
将培养液通过离心收集菌体,重悬菌体于裂解缓冲液中,通常包括碱性条件和去氧胆酸钠(SDS)进行细胞裂解,释放DNA。
中和沉淀
加入酸性的中和缓冲液,以使得蛋白质和杂质沉淀,同时质粒DNA保持在溶液中。
清洗和纯化质粒DNA
借助离心、滤纸、离心柱或试剂盒等工具,去除沉淀和细胞碎片,收集上清液并抽取质粒DNA。
质粒DNA沉淀和洗涤
通常使用乙醇或异丙醇引入DNA的沉淀,随后使用70%乙醇洗涤,去除不必要的盐和杂质。
气干和重悬
沉淀后,轻微气干沉淀的DNA以去除余留的乙醇,然后在TE缓冲液或纯水中重悬。
如何分析电泳图谱
准备琼脂糖凝胶
将琼脂糖粉与TAE或TBE缓冲液混合,并加热至琼脂糖完全融化。冷却后,添加核酸染料(如GelRed或EB)并倒入凝胶成型器中。
样品制备
将提取的质粒DNA与加载缓冲液(含有甘油和染料)混合,以增加沉降密度并增加可见性。
加载和电泳
当凝胶凝固后,将样品加载至凝胶孔中,通电使DNA分子在电场中运动,DNA由于负电荷的原因,会向阳极移动。
染色和成像
电泳结束后,如果没有使用预染色方法,可以将凝胶浸泡在染料中以显影。然后使用紫外线成像系统观察和拍摄DNA条带。
图谱分析
质粒DNA通常以单股圈状(SC)、双股圈状(CC)以及线性(L)形式出现。大小和形态不同的DNA会在电泳中迁移速度不同,因此可以通过条带的位置判断质粒的大小和形态。使用分子量标准对照(DNA ladder),可以估计质粒DNA的近似大小。
结果解释
分析得到的图谱,根据质粒DNA条带的明显度和大小,判断提取和纯化的效果。一个明亮且位置正确的DNA条带通常表示提取成功。
对于新手而言,操作中需要特别注意避免混入核酸酶,可能导致DNA降解,理解试剂的功能和质粒DNA可能存在的形式对解读图谱至关重要。随着经验的积累,科研小白相信你会在提取质粒和分析电泳图谱这一领域变得游刃有余。