在基因沉默和基因治疗的领域，腺相关病毒(Adeno-associated virus, AAV)载体已成为传递短发夹RNA (shRNA) 的有力工具。shRNA通过RNA干扰(RNAi)机制在转录后水平靶向并降解特定mRNA，用以研究基因功能或治疗遗传性疾病。利用AAV载体可在多种哺乳动物细胞中实现稳定、长期的基因沉默。本文介绍了针对哺乳动物细胞设计和构建shRNA表达的AAV载体的关键点。
1. shRNA设计：
精确设计shRNA序列是确保其功能性的基础。利用在线工具分析靶基因序列，选择高效、特异性强的shRNA靶点，并规避可能的脱靶效应。设计中也需考虑shRNA的结构稳定性和转录效率。
2. AAV载体的选择：
选取适合的AAV表达载体，该载体应包含引导shRNA成熟和加工的RNA Polymerase III的启动子，如U6或H1启动子。此外，载体还应插入标记基因或报告基因，以便于追踪和筛选成功转染的细胞。
3. 克隆与验证：
通过基因合成或PCR扩增获得shRNA表达盒，并将其克隆到AAV载体中。之后，通过限制性酶切和序列测定验证正确的克隆。
4. AAV的生产与浓缩：
在辅助细胞系，如HEK293细胞中，使用AAV辅助包装质粒共转染载体质粒，以生产无复制能力的AAV颗粒。根据目标应用，产生的AAV颗粒可以采用不同的方法进行浓缩和纯化。
5. 滴度测定：
准确测定AAV载体的滴度对于实验和临床应用至关重要。常用的滴度测定包括实时PCR定量病毒基因组拷贝数或使用ELISA检测病毒颗粒中的蛋白含量。
6. 功能性验证：
在目标细胞或模型中评估shRNA介导的基因沉默效应。可以借助Western blot、RT-qPCR或功能性实验来评估特定基因表达的下调及其生物学效应。
7. 体内应用考量：
如果AAV-shRNA载体计划用于体内研究或治疗实验，则需选择合适的AAV血清型以保证足够的组织特异性和转导效率。此外，还需关注免疫原性以及可能的毒性反应。
借助现代分子生物学工具，通过上述流程构建的AAV-shRNA载体尤其适用于长期稳定沉默哺乳动物细胞中特定基因的表达。通过进一步的临床前研究，这些系统有潜力为治疗遗传性疾病提供革命性的策略。