基因治疗领域的重要工具——重组腺相关病毒(rAAV)因其优良的传递特性和低免疫原性受到广泛的关注。rAAV的包装过程涉及将外源DNA片段打包进AAV衣壳，形成能够高效传递基因的病毒颗粒。以下是rAAV包装流程的基本步骤及其关键技术点：
1. 表达质粒和助病毒质粒的准备：
这些质粒通常包含有编码AAV衣壳蛋白和助病毒功能(如腺病毒辅助功能)所需的基因。同时，针对所需传导的基因制备重组AAV质粒，其中包含有推动外源基因表达的启动子以及对应的表达序列。
2. 细胞培养：
通常使用HEK 293细胞作为载体生产宿主，因其在转染过程中能有效合作和表达插入的质粒。稳定且高效的细胞培养环境是高产量生产rAAV的前提。
3. 同时转染生产细胞：
细胞在合适的培养条件下生长至90%左右的传代时，同时用表达质粒和助病毒质粒进行转染。这个过程可以通过不同的转染方法实现，如利用钙磷沉淀、脂质体介导的转染等。
4. 收集细胞和病毒颗粒：
在转染后一定时间内，细胞会释放含有重组AAV颗粒的培养上清。在适当的时间点，收集培养物，并且通常将细胞也一并收集，因为细胞内部也会含有大量的病毒颗粒。
5. 病毒纯化：
收集得到的病毒裂解液需经过一系列步骤进行纯化，比如通过超速离心、离子交换色谱和/或亲和色谱等方法去除杂质和未包装的质粒DNA，最终获得高纯度的rAAV。
6. 病毒颗粒定量和质控：
为确保产品质量，必须对完成的rAAV颗粒进行严格的定量和质量控制检测。通常使用PCR、ELISA、西方印迹以及感染效率实验等一系列方法来确定病毒颗粒的滴度、纯度和生物活性。
7. 存储：
纯化和定量检测后的rAAV样品，需要在适当的条件下储存，通常推荐-80℃以下的条件，以确保病毒颗粒的稳定性和活性。
整个rAAV包装过程是一个技术密集型和相对复杂的动态过程，其要求从分子水平到生物工程层面上的精细操作。对于每一个环节的细微调节和优化都可能显著影响到最终产品的质量，这直接关联着rAAV后续在基因治疗中的应用效果。
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