腺相关病毒(AAV)包装的关键考虑事项

2024年6月5日
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腺相关病毒(AAV)是一种小型的非包膜病毒,它能够在广泛的宿主细胞中介导高效的基因传递,因此被广泛应用于基因治疗和疫苗开发等领域。然而,要获得高效和特异性的AAV载体,整个包装过程需要精心规划和管理。以下是AAV包装过程中需要注意的几个关键点:

启动子选择:构建AAV载体时首先要考虑的是启动子的选择,因为它决定了基因表达的强弱和特异性。为了适应不同的治疗目标和组织特异性,通常会选择组织特异性启动子、病毒启动子或细胞型特异性启动子等。

载体设计与构建:AAV载体设计需兼顾病毒包装容量限制(一般为4.7kb以内)。在设计过程中,应当尽量避免重复序列和不稳定结构,以减少重组现象和提高载体的稳定性。

AAV血清型的选择:不同的AAV血清型决定了病毒的感染特异性和体内传递能力。选择合适的血清型可以增强病毒向目标组织的传递效率,例如AAV2常用于眼科治疗,AAV9则因其能够跨越血脑屏障而被用于中枢神经系统相关疾病。

生产细胞线的选取:HEK293细胞是生产AAV的常用细胞系,因为它们具有较高的转染效率和AAV产出量。确保使用的细胞健康、无污染且传代次数合适是生产过程中的又一重要因素。

重组AAV的生产:重组AAV的生产通常采用三质粒共转染系统,包括载体质粒、助病毒质粒和包装质粒。正确的质粒构建和比例搭配对于提高产量至关重要。

转染方法的优化:利用物理方法(如电穿孔)或化学方法(如二乙氨基硫代巯基乙酸盐转染)等,转染效率可能会有较大差异。根据选用细胞系,应优化转染条件以提升AAV的生产效率。

纯化和浓缩:AAV纯化一般采用梯度离心和柱层析方法,去除无效病毒颗粒和细胞残渣,以获得高纯度、高滴度的病毒制剂。后续步骤,例如透析或超滤,可用于浓缩病毒制剂,同时去除不必要的蛋白质和其他杂质。

测量和质量控制:基因拷贝数(GCN)、感染滴度和病毒颗粒总数量等指标是评估病毒制剂质量的关键参数。实施严格的质量控制流程,包括病毒滴度测定、实时PCR、蛋白质分析、核酸序列验证等步骤,保证病毒制剂的有效性和安全性。

确保生产环境和操作规程的合规性:遵守当前良好生产规范(cGMP)和生物安全规定,确保生产环境无污染,操作人员需严格按照操作规程进行操作,防止交叉污染和其他潜在的生产风险。

生物安全性考量:进行AAV包装的实验室和生产设施需要有适当的生物安全设施和措施,确保操作人员和环境安全,避免病毒泄露。

综上所述,AAV包装是一个复杂而精 细的工作,从载体设计到最后的病毒制剂质检,每一步都需精心规划和严格执行,只有确保每个环节的高标准和高质量,才能生产出高安全性、高效率的AAV基因治疗载体。随着生物技术的不断发展,未来会有越来越多的优化策略帮助科研人员和生产者提高AAV载体包装的效率和质量,从而惠及基因治疗的发展。

关于派真

作为一家专注于AAV 技术十余年,深耕基因治疗领域的CRO&CDMO,派真生物可提供从载体设计、构建到 AAV、慢病毒和 mRNA 服务的一站式解决方案。凭借深厚的技术实力、卓越的运营管理和高标准的服务交付,我们为全球客户提供一站式CMC解决方案,包括从早期概念验证、成药性评估到IITINDBLA的各个阶段。

 

凭借我们独立知识产权的π-alphaTM 293 细胞AAV高产技术平台,我们能将AAV产量提高多至10倍,每批次产量可达1×10¹⁷vg,以满足多样化的商业化和临床项目需求。此外,我们定制化的mRNA和脂质纳米颗粒(LNP)产品及服务覆盖药物和疫苗开发的各个阶段,从研发到符合GMP的生产,提供端到端的一站式解决方案。

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