腺相关病毒（AAV）载体的制备是基因治疗研究中非常关键的一步。AAV因其安全性高、免疫原性低等优点，广泛用于基因转导。AAV载体的制备过程一般包括以下关键步骤：
1. 选择并构建表达质粒
基因插入：首先选择目标基因，并构建适合的表达质粒。通常包含目标基因的表达盒、启动子、IRES（内转录增强子）和标记基因。
质粒设计：需要设计AAV质粒和辅助质粒。AAV质粒含有目标基因和AAV的反向末端重复序列（ITR），辅助质粒则携带AAV的结构基因（如Rep和Cap基因）。
2. 转染细胞
选择细胞系：AAV载体常用HEK293T等细胞系来表达。HEK293T细胞具有较高的转染效率。
转染混合物：将含有目标基因、Rep/Cap蛋白和辅助质粒（如腺病毒辅助质粒）的混合物转染到细胞中。
细胞培养：将转染后的细胞培养至病毒载体的高表达水平。
3. 病毒收集与纯化
细胞裂解：采用冻融、超声等方法破坏细胞，释放病毒颗粒。
密度梯度离心或层析纯化：为了获得高纯度的AAV载体，常使用密度梯度离心（如氯化铯密度梯度）或柱层析法（如阴离子交换层析）。
4. 病毒浓缩
超滤浓缩：使用超滤柱进一步浓缩病毒载体，以达到所需的病毒滴度。
5. 滴度测定与质控
滴度测定：通常使用qPCR或ELISA来测定AAV的基因组滴度，确保浓度达到实验要求。
纯度与完整性检测：通过SDS-PAGE、Western Blot等方法评估病毒的纯度、颗粒完整性，保证病毒制备质量。
内毒素检测：使用LAL试验等方法检测病毒制备中是否含有内毒素。
6. 贮存与保存
分装与冷冻保存：将病毒载体分装后置于-80°C保存，以保持其活性。