腺相关病毒AAV载体设计

2024年11月18日
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腺相关病毒(Adeno-Associated Virus, AAV)是一种常用于基因治疗和基因功能研究的载体。AAV因其安全性高、免疫原性低和能够长时间表达目的基因而受到广泛关注。在设计AAV载体时,需要综合考虑多个因素以优化其效率和安全性。

以下是设计AAV载体的关键步骤和注意事项:

1. 选择AAV血清型

AAV有多种血清型(如AAV1-AAV9等),不同血清型具有不同的组织特异性和感染能力:

AAV2:最常用的血清型,适合多种细胞和组织。

AAV9:对心肌和中枢神经系统具有高亲和力。

AAV8:具有高效的肝脏转染能力。

AAV6:对肌肉和肺组织较有效。

选择血清型时需根据实验目标组织或细胞类型进行优化。

 

2. 启动子选择

启动子决定目的基因的表达水平和特异性:

通用启动子:如CMV、EF1α,适合广泛表达。

组织特异性启动子:如Syn(神经)、LCK(T细胞)、Alb(肝脏)。

诱导型启动子:如Tet-On/Tet-Off,用于可控表达。

 

3. 目的基因插入

大小限制:AAV载体的最大包装容量约为4.7 kb,包括反向末端重复序列(ITRs)。

编码框架优化:目的基因需去除非必要序列,并考虑密码子优化以提高表达效率。

多基因表达:可以使用双启动子设计或自剪切多顺反子结构(如2A肽)。

 

4. 增强元件的添加

添加增强子或调控序列(如WPRE元件或PolyA信号)以提高基因的表达水平。

 

5. 设计安全性

去除野生型AAV遗传信息:确保载体仅携带目的基因及必需序列,避免潜在的病毒复制。

减少免疫原性:选择合适的启动子和元件以降低宿主免疫反应。

 

6. 生产与纯化

包装细胞系:如HEK293T细胞,提供必要的病毒蛋白和辅助病毒基因。

纯化技术:如CsCl梯度离心法或柱层析(如离子交换层析),以获得高滴度和高纯度的病毒。

 

7. 验证与质控

滴度测定:通过qPCR或ELISA确定病毒颗粒浓度。

生物活性验证:使用体内或体外实验确认目的基因的表达和功能。

安全性评估:检测潜在的基因组整合或免疫反应。

 

AAV载体设计是一个需要高度定制的过程,需综合实验需求和组织特性,以实现最佳的基因传递和表达效果。如果有具体设计目标或需要更多帮助,可以进一步讨论!

关于派真

作为一家专注于AAV 技术十余年,深耕基因治疗领域的CRO&CDMO,派真生物可提供从载体设计、构建到 AAV、慢病毒和 mRNA 服务的一站式解决方案。凭借深厚的技术实力、卓越的运营管理和高标准的服务交付,我们为全球客户提供一站式CMC解决方案,包括从早期概念验证、成药性评估到IITINDBLA的各个阶段。

 

凭借我们独立知识产权的π-alphaTM 293 细胞AAV高产技术平台,我们能将AAV产量提高多至10倍,每批次产量可达1×10¹⁷vg,以满足多样化的商业化和临床项目需求。此外,我们定制化的mRNA和脂质纳米颗粒(LNP)产品及服务覆盖药物和疫苗开发的各个阶段,从研发到符合GMP的生产,提供端到端的一站式解决方案。

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