腺相关病毒（AAV）的包装系统是用于生产重组AAV（rAAV）颗粒的关键平台。rAAV是一种常用的基因载体，广泛应用于基因治疗和基础研究中。构建AAV包装系统的目标是通过在细胞中共表达必要的组分，包装出功能性病毒颗粒。以下是AAV包装系统的基本构建和原理：
一、AAV包装系统的基本组成
AAV包装系统通常包括以下三个关键组分：
1。AAV载体质粒（Transfer Plasmid）
包含目标基因（转基因）和两端的倒位重复序列（ITR）。
ITR是唯一保留的AAV序列，用于引导基因组的复制和包装。
转基因通常由适当的启动子和增强子驱动表达。
2.AAV辅助质粒（Helper Plasmid）
提供AAV的Rep（复制相关蛋白）和Cap（衣壳蛋白）基因，这些基因负责病毒基因组的复制和病毒颗粒的组装。
Rep蛋白负责病毒基因组的复制和包装，而Cap蛋白（VP1、VP2、VP3）构成病毒的衣壳。
3.辅助病毒质粒或功能（Helper Virus Functions）
提供腺病毒（或其他辅助病毒）所需的功能，但不产生感染性腺病毒。
一般通过辅助质粒（如pHelper）提供，这些质粒编码腺病毒的E2A、E4ORF6和VA RNA，它们在AAV的复制和表达中至关重要。
二、AAV包装系统的构建步骤
1.选择宿主细胞系
一般使用HEK293细胞或其他工程化细胞系，因为它们容易转染且适合大规模培养。
HEK293细胞天然表达腺病毒的E1基因，有助于辅助病毒功能的提供。
2.共转染质粒
通过共转染方式将上述三个质粒（AAV载体质粒、AAV辅助质粒、辅助病毒质粒）转染到HEK293细胞中。
使用高效的转染试剂（如PEI、Lipofectamine）或电穿孔技术。
3.病毒颗粒的生成
在细胞中，ITR引导目标基因的复制，Rep和Cap蛋白组装出完整的rAAV颗粒。
目标基因被包裹在AAV衣壳中。
4.病毒颗粒的收获和纯化
收集细胞和培养基，裂解细胞以释放病毒颗粒。
使用纯化技术（如PEG沉淀、CsCl梯度离心、离子交换色谱或亲和柱纯化）获得高纯度的rAAV。
三、改进的包装系统
1.三质粒系统
包括AAV载体质粒、AAV辅助质粒和腺病毒辅助质粒。
优点：简单高效，不依赖活体病毒，安全性高。
2.双质粒系统
将AAV辅助质粒和腺病毒辅助质粒整合为一个质粒，减少转染步骤和复杂性。
3.细胞系优化
一些细胞系（如稳定表达Rep和Cap的工程化细胞）进一步简化了包装过程，仅需转染AAV载体质粒。
4.无病毒辅助系统
通过基因工程方法替代腺病毒功能，进一步提高安全性。
AAV包装系统的核心是通过提供Rep和Cap蛋白、辅助病毒功能以及目标基因，生成功能性病毒颗粒。随着技术的进步，AAV包装系统不断优化，以提高生产效率、纯度和安全性，适应不同的研究和临床需求。