腺相关病毒aav三质粒包装的原理

2024年11月27日
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AAV(腺相关病毒)的三质粒包装系统是一种常用的生产重组AAV的方法。这种方法基于三种质粒的协同作用,确保目标基因被包装到AAV颗粒中,同时维持病毒的高效生产和安全性。以下是其基本原理:

1. 三质粒的组成

质粒1:携带目标基因的质粒

包括目标基因及其调控元件(如启动子和增强子)。

两端有 ITR(反向末端重复序列),是AAV基因组的必要元件。ITR引导基因组被包装到病毒颗粒中。

质粒2:包装质粒

提供AAV的 Rep 和 Cap 基因,分别负责复制AAV基因组和组装病毒衣壳。

Rep 基因:负责基因组的复制和整合。

Cap 基因:编码AAV的衣壳蛋白(VP1、VP2、VP3)。

质粒3:辅助质粒

提供辅助病毒基因(如腺病毒的E1A、E1B、E4和VA基因,或疱疹病毒基因),增强AAV的复制和包装效率。

这些基因使AAV能够在没有辅助病毒感染的情况下完成高效生产。

2. 操作过程

共转染:将上述三种质粒共同转染到适合的宿主细胞中(通常是HEK293细胞,因其内含腺病毒的E1基因,能提供额外的辅助功能)。

表达与组装

  • 目标基因在ITR序列引导下被复制。
  • Rep蛋白和Cap蛋白协助将目标基因包装进AAV衣壳中。

病毒释放:通过细胞裂解或超声波处理,释放病毒颗粒。

纯化与浓缩:利用密度梯度离心、离子交换柱等方法纯化病毒。

3. 三质粒系统的优势

安全性高:与传统的腺病毒辅助系统相比,三质粒系统不需要活病毒辅助,减少了生物安全风险。

高效性:简化了AAV病毒颗粒的生产流程,提高了包装效率。

灵活性强:目标基因序列和调控元件可以根据需求灵活设计,适用于不同的研究和应用。

4. 关键注意点

ITR序列完整性:ITR序列是包装的核心,质粒的构建需确保其完整性。

转染效率:HEK293细胞的状态和转染条件直接影响包装效率。

纯化过程:为避免蛋白污染或不完整颗粒的干扰,纯化步骤需严格优化。

这种系统广泛用于基因治疗、功能研究和疫苗研发,是当前AAV生产的标准方法之一。

关于派真

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