AAV（腺相关病毒）的三质粒包装系统是一种常用的生产重组AAV的方法。这种方法基于三种质粒的协同作用，确保目标基因被包装到AAV颗粒中，同时维持病毒的高效生产和安全性。以下是其基本原理：
1. 三质粒的组成
质粒1：携带目标基因的质粒
包括目标基因及其调控元件（如启动子和增强子）。
两端有 ITR（反向末端重复序列），是AAV基因组的必要元件。ITR引导基因组被包装到病毒颗粒中。
质粒2：包装质粒
提供AAV的 Rep 和 Cap 基因，分别负责复制AAV基因组和组装病毒衣壳。
Rep 基因：负责基因组的复制和整合。
Cap 基因：编码AAV的衣壳蛋白（VP1、VP2、VP3）。
质粒3：辅助质粒
提供辅助病毒基因（如腺病毒的E1A、E1B、E4和VA基因，或疱疹病毒基因），增强AAV的复制和包装效率。
这些基因使AAV能够在没有辅助病毒感染的情况下完成高效生产。
2. 操作过程
共转染：将上述三种质粒共同转染到适合的宿主细胞中（通常是HEK293细胞，因其内含腺病毒的E1基因，能提供额外的辅助功能）。
表达与组装：
- 目标基因在ITR序列引导下被复制。
- Rep蛋白和Cap蛋白协助将目标基因包装进AAV衣壳中。
病毒释放：通过细胞裂解或超声波处理，释放病毒颗粒。
纯化与浓缩：利用密度梯度离心、离子交换柱等方法纯化病毒。
3. 三质粒系统的优势
安全性高：与传统的腺病毒辅助系统相比，三质粒系统不需要活病毒辅助，减少了生物安全风险。
高效性：简化了AAV病毒颗粒的生产流程，提高了包装效率。
灵活性强：目标基因序列和调控元件可以根据需求灵活设计，适用于不同的研究和应用。
4. 关键注意点
ITR序列完整性：ITR序列是包装的核心，质粒的构建需确保其完整性。
转染效率：HEK293细胞的状态和转染条件直接影响包装效率。
纯化过程：为避免蛋白污染或不完整颗粒的干扰，纯化步骤需严格优化。
这种系统广泛用于基因治疗、功能研究和疫苗研发，是当前AAV生产的标准方法之一。