它主要包括三种方法：鉴定自然存在的AAV变体、理性设计和定向进化。最近，AI辅助进化已成为rAAV衣壳设计的新工具。
01、鉴定自然存在的AAV变体
鉴于多数人对已知野生型AAV血清型有抗体，研究人员正在寻找新的AAV血清型或变体，特别是人类来源的变体，以提高基因治疗的转导效率和避免预存抗体的中和效应。其中，AAVv66作为一种从人类样本中分离出的AAV2变体，显示出更高的产量和CNS转导效率，表明自然存在的AAV变体可能为提高组织特异性转导提供有价值工具，尽管目前临床研究中主要还是使用源自野生型AAV血清型的rAAV。
02、理性设计
通过遗传突变技术，对rAAV衣壳蛋白的特定氨基酸残基进行修改，可以显著改变其转导效率和靶向性等特性。例如，磷酸化rAAV2衣壳表面的酪氨酸残基能够增强其在中枢神经系统中的基因递送效率，甚至达到感染光感受器细胞的效果。另外，将黑猩猩来源的H527Y和R533S替换引入rAAV9衣壳后，在小鼠模型中通过静脉注射的方式，发现其外周组织的感染情况明显减少。
通过理性设计方法将功能结构域引入rAAV衣壳的特定位点，以实现特定的功能改进和转基因表达效果。如rAAV9衣壳中插入细胞穿透肽，增强了其转导效率和穿越血脑屏障的能力。针对宿主免疫反应这一主要障碍，通过结构研究和工程化改造rAAV衣壳，使其能够逃避中和抗体的识别。此外，通过域交换和插入特定基序来进一步优化rAAV的靶向性和感染效率。
通过关于不改变rAAV衣壳氨基酸组成的化学修饰而影响感染和嗜性等特点。如通过微小的表面氨基酸修改或利用化学修饰技术，使用PEG-NHS交联或共价结合特定抗体，可以改变rAAV的受体结合亲和力和感染嗜性，从而逃避中和抗体并提高转基因表达效率。此外，遗传密码扩展技术的应用使得在rAAV衣壳中引入非天然氨基酸成为可能，进一步拓展了rAAV的功能和特异性。
03、定向进化
Voyager Therapeutics公司开发了一种名为TRACER的新型rAAV进化平台，该平台通过细胞类型特异性表达RNA来重新定向AAV的嗜性，特别是针对穿透血脑屏障并增强中枢神经系统（CNS）嗜性的AAV衣壳。该方法不需要转基因动物，适用于多种物种，包括非人灵长类动物。通过TRACER平台，研究人员成功鉴定出多个优势变体，如VCAP-102和VCAP-100衍生物，它们在大脑中的感染效率显著提高，同时肝毒性降低，为基因治疗中枢神经系统疾病提供了更有前景的工具。
TRACER策略
DELIVER策略作为一种开创性的方法，通过体内筛选AAV衣壳变体来实现对特定组织（如肌肉组织）的高效递送。该策略已成功鉴定出含有RGD基序的衣壳，这些衣壳在静脉注射后能以更高的效率和选择性感染目标组织。进一步的研究还生成了嵌入RGD的肽库，并鉴定出新的AAV衣壳变体，其骨骼肌转导效率显著提高，为基因治疗肌肉相关疾病提供了更有效的工具。
DELIVER鉴定出一类含有RGD基序的肌肉趋向性AAV衣壳变体。
04、AI辅助设计
计算机辅助的rAAV工程利用计算工具来设计和优化rAAV，通过探索进化谱系、重建祖先基因组等方法生成具有更好生物学属性的衣壳变体。如AI辅助设计的Anc80L65有望用于内耳或眼睛相关疾病的基因治疗。此外，机器学习在生物医学研究，包括医学图像分析、遗传学和药物发现等得到广泛应用。
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