rAAV基因组的设计策略包括修改ITRs或内含子，插入组织特异性启动子进行转录调控和/或使用可诱导表达系统，密码子优化，减少转基因cDNA的CpG基序，以及通过微小RNA（miRNA）介导的转录后调控重靶向等，它们决定了转基因表达、细胞类型特异性、rAAV转导的安全性和持久性。
01、ITRs的设计
传统的rAAV携带单链基因组，转导效率受限。采用自互补AAV（scAAV）策略可提高效率，但包装能力受限且免疫反应风险增加。ITRs的修改可调节包装正链或负链，但移除CpG虽不影响治疗效果却可能降低滴度。此外，ITRs的异质性源于其天然易突变、回文结构、高GC含量和二级结构，优化GC含量可能是改善rAAV的设计策略。进行rAAV ITRs的设计时，需要综合实际情况，通过优化各个参数以设计出更适合特定应用场景的rAAV载体。
02、优化启动子
选择和优化转基因表达盒中的启动子对于满足特定需求至关重要，特别是组织特异性启动子能够实现低剂量下的高效转导并最小化脱靶效应。通过采用内源性启动子、添加上游增强子以及利用机器学习设计组织特异性启动子等策略，可以显著提高转基因表达的活性和特异性，从而在基因治疗中取得更好的治疗效果和安全性。如小鼠甲基-CpG结合蛋白-2启动子的一个片段在神经元中特异性地实现了强大的长期表达。
03、转基因表达调控
转录调控：可以上调或下调感兴趣基因或蛋白的表达，以优化和微调所需的效果。研究者们开发了一种基于免疫抑制药物雷帕霉素的反应性转录因子系统。该系统能够在雷帕霉素的作用下实现可诱导的剂量-反应表达，而在未添加雷帕霉素时，转基因的表达水平则保持极低，从而确保了该系统的高特异性和安全性。
转录后调控：核糖开关作为一种转录后调控策略，在细菌基础代谢中发挥重要调控作用，并且因其具有与FDA批准的药物兼容、RNA尺寸小、免疫原性低以及序列短等优点，成为调控rAAV基因治疗的强大系统。此外，非编码RNA也是转基因调控中的多功能工具，通过整合RNA aptamers到转基因的5′-非翻译区中，可以实现基因表达的精确控制。同时，研究者们还在探索使用药物诱导剪接等机制来进一步精细调控基因表达，以实现目标基因表达水平的精确激活和降低。
翻译后调控：利用蛋白质降解系统（degron）可以调节感兴趣蛋白质的半衰期，实现对蛋白质移除和恢复的可逆、快速响应。尽管将degron系统从体外转化为体内面临毒性挑战，但通过优化已产生有前景的体内应用系统，如结合SMASh(small-molecule–assisted shutoff)标签和小分子药物。结合多种策略，如可诱导表达系统、替代剪接和蛋白质降解方法，有望实现对目标蛋白表达水平的精细控制。
04、优化转基因（转录后水平）
这种重构可以在遗传信息流的不同阶段发生。在DNA水平上，可以通过rAAV ITRs、部分转基因序列或在两个rAAV基因组中都存在的优化的重组元件来促进载体间DNA重组。重叠序列可以在转录后通过特别设计的剪接信号被切除，产生成熟的全长mRNA，随后被翻译成所需的蛋白。在RNA水平上，通过每个转录本中存在的剪接供体和受体介导的两个单独载体的转录本之间的跨剪接，生成全长转录本和蛋白。在蛋白水平上，可以通过分裂型内含肽（分裂型内含肽是能够切除自身并连接附近蛋白片段的天然多肽）实现蛋白重构。
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