AAV载体的制备是一个多步骤的过程，包括质粒构建、细胞培养、转染、病毒收获、纯化及质量控制等环节。整个过程需要严格的操作标准和质量把控，确保最终获得高效、高纯度的病毒载体。以下是AAV（腺相关病毒）载体的制备过程几个关键步骤。
1. 质粒准备与构建
AAV载体的制备需要以下几种质粒：
重组质粒（载体质粒）： 包含目的基因（转基因）和AAV的反向末端重复序列（ITRs）。
辅助质粒（帮助质粒）： 提供AAV复制所需的辅助功能，通常包括腺病毒的辅助基因（如E2A、E4和VA基因）。
包装质粒： 包含AAV衣壳蛋白（Cap）和复制蛋白（Rep）的编码序列。
质粒构建完成后，需要通过细菌扩增、提取和纯化高质量的质粒DNA。
2. 细胞培养与转染
选用包装细胞系，如HEK293细胞，这些细胞含有腺病毒E1基因，能辅助AAV的复制和包装。
将上述质粒混合（如使用质粒三重转染法），通过转染试剂（如PEI或脂质体）转染到HEK293细胞中。
转染后，质粒进入细胞内，载体质粒上的目的基因开始表达，同时辅助质粒和包装质粒的基因协同作用，启动AAV的复制和衣壳蛋白组装。
3. 病毒生产与细胞培养
转染完成后，细胞在培养基中继续培养约48-72小时。
在此期间，AAV病毒颗粒在细胞内合成并逐渐完成组装，最终累积在细胞中或培养上清中。
4. 病毒收获
根据AAV颗粒的分布情况，可以选择以下方法收获：
细胞裂解法： 通过冻融法或超声波裂解细胞，释放细胞内的病毒颗粒。
培养上清法： 如果AAV颗粒分泌到上清中，则直接收集上清。
5. 纯化
AAV病毒颗粒需要经过纯化以去除杂质。常用的纯化方法包括：
PEG沉淀法： 使用聚乙二醇沉淀病毒颗粒。
CsCl梯度离心法： 通过密度梯度超速离心将病毒颗粒纯化。
离子交换层析法： 根据病毒颗粒的电荷特性进行纯化。
亲和层析法： 使用特异性结合AAV衣壳蛋白的抗体或配体纯化病毒颗粒。
6. 浓缩与去除杂质
纯化后的病毒液体积较大，可使用超滤浓缩法进行浓缩。
此外，进行去内毒素、去除宿主DNA和RNA等残留杂质的处理，确保病毒载体的纯度和安全性。
7. 病毒滴度检测与质量控制
滴度检测： 通过qPCR、ELISA或生物学方法检测病毒颗粒的滴度（vg/mL或TU/mL）。
质量控制： 检测纯度、内毒素水平、宿主蛋白污染和病毒基因组的完整性等指标。
8. 病毒储存
纯化后的AAV病毒载体通常储存于低温（-80°C） 条件下，以保持其感染活性和稳定性。