腺相关病毒（AAV）包装失败可能由多种因素引起，涉及质粒设计、细胞状态、生产工艺和实验操作等方面。以下是一些常见的原因：
1.外源基因大小限制
AAV的基因组较小，大约只有4.7kb，这限制了可以插入的外源基因的大小。过大的外源基因或过长的启动子序列可能会导致AAV包装时构建不稳定，从而失败。
2.细胞问题
细胞状态不佳：包装使用的细胞株（如HEK293、HEK293T）状态不佳、活性降低，影响转染效率和病毒颗粒产量。细胞污染（细菌、支原体、真菌污染等），导致病毒包装失败。
细胞密度不合适：细胞过度融合或密度太低，会影响转染和病毒颗粒的产生。
细胞转染效率低：质粒转染效率不高，导致病毒蛋白表达不足，影响病毒包装。
3.质粒问题
质粒结构设计不合理：转基因载体构建错误，导致基因无法被正确表达或组装到AAV颗粒中。ITR（倒置末端重复序列）序列受损或变异，ITR是AAV包装的关键元件，如果其完整性受损，病毒包装将失败。
质粒质量问题：质粒制备过程中存在内毒素、RNA、蛋白等杂质，影响细胞转染效率和病毒颗粒产生。质粒浓度过低或质粒降解。
辅助质粒或帮助质粒缺失：AAV生产需要多个质粒协同作用，包括转基因质粒、辅助质粒（提供Rep/Cap基因）和腺病毒帮助质粒（如Ad5基因的E2A、E4等辅助元件），缺一不可。
4.包装容量限制
AAV的包装容量限制在约4.7kb，这使得传递大型基因产品成为一个挑战。
5.基因载体和转基因的影响
转基因毒性：被包装的基因对细胞有毒性，导致细胞死亡或病毒无法组装。
基因长度过大：AAV的包装容量限制约为 4.7 kb，若转基因超过此限制，会导致无法完全包装到病毒颗粒内。
6.辅助病毒因子缺失
AAV包装需要腺病毒帮助因子的辅助（例如E1A、E2A、E4和VA RNA等）。如果这些因子表达不足，病毒的复制和组装会受阻。
7.rep/cap基因的表达和放大
在稳定的rep/cap包装细胞中，rep和cap基因的表达和放大对于rAAV的生产至关重要。某些情况下，需要腺病毒提供的特定因子来支持rep/cap DNA的放大。
这些因素共同作用可能导致AAV包装失败，科研人员需要仔细分析失败的原因，并针对性地优化实验方案以提高AAV包装的成功率。
关于派真
作为一家专注于AAV 技术十余年，深耕基因治疗领域的CRO&CDMO，派真生物可提供从载体设计、构建到 AAV、慢病毒和 mRNA 服务的一站式解决方案。凭借深厚的技术实力、卓越的运营管理和高标准的服务交付，我们为全球客户提供一站式CMC解决方案，包括从早期概念验证、成药性评估到IIT、IND及BLA的各个阶段。
凭借我们独立知识产权的π-alphaTM 293 细胞AAV高产技术平台，我们能将AAV产量提高多至10倍，每批次产量可达1×10¹⁷vg，以满足多样化的商业化和临床项目需求。此外，我们定制化的mRNA和脂质纳米颗粒（LNP）产品及服务覆盖药物和疫苗开发的各个阶段，从研发到符合GMP的生产，提供端到端的一站式解决方案。
