AAV（腺相关病毒）载体是一种常用的基因治疗工具，因其低致病性、低免疫原性以及能够感染多种细胞而受到广泛关注。制备AAV载体的过程通常分为以下几个步骤：
1. 设计AAV载体骨架
目标基因插入：将目标基因插入到AAV载体的逆转录区（ITR）之间。ITR序列是AAV复制和包装的必要元件。
启动子和调控元件：选择合适的启动子（如CMV、CAG、EF1α）以驱动目标基因的表达，同时可以加入增强子或组织特异性元件。
报告基因（可选）：为了验证表达效果，可以加入报告基因（如GFP、RFP）。
质粒构建：构建含有目标基因的AAV质粒。
2. 三质粒共转染法生产AAV
常用293T或HEK293细胞作为宿主细胞。
三质粒系统：
包装质粒（Rep/Cap）：提供AAV的复制（Rep）和衣壳蛋白（Cap）编码基因。
辅助质粒：提供腺病毒的辅助功能（如E1A、E1B）。
目标质粒：含有目标基因和ITR序列。
转染步骤：
将细胞培养至约70-80%融合度。
使用转染试剂（如PEI或Lipofectamine）将上述质粒共转染入细胞中。
培养3-5天，让病毒充分表达和装配。
3. AAV病毒的收获
细胞收集：培养液中大部分病毒尚未释放，需连同细胞一起收集。
裂解细胞：通过冷冻融化循环、超声波或化学裂解方法破坏细胞，释放病毒颗粒。
去除杂质：使用离心或过滤去除细胞碎片。
4. AAV病毒的纯化
层析方法：
离心密度梯度（如CsCl或碘化铯梯度离心）。
柱层析（如阴离子交换层析、亲和层析）。
浓缩：使用超滤装置或PEG沉淀法浓缩病毒。
5. 病毒滴度测定
测定病毒滴度以确保实验可控：
qPCR：检测病毒基因组数。
ELISA：检测病毒衣壳蛋白含量。
生物活性检测：转导靶细胞，检测目标基因表达。
6. 存储与应用
存储：病毒可以在低温（-80°C）下长期保存，避免反复冻融。
使用：根据实验需求调整病毒浓度并感染靶细胞或动物模型。