慢病毒纯化是慢病毒载体研究和生产的重要环节，保证其高滴度和高纯度对后续实验和应用至关重要。以下是慢病毒纯化的关键要点：
1. 病毒收集
时间选择：慢病毒通常在转染后48-72小时达到最高滴度，需在此时间段内收集培养基。
收集次数：可以多次收集上清液（如48小时和72小时），以提高总产量。
离心去杂质：初步去除细胞碎片和杂质，通常以低速离心（如1500-2000 rpm，10分钟）清除细胞残留。
2. 过滤
孔径选择：使用0.45 μm或0.22 μm滤膜过滤培养上清液，以进一步去除较大的颗粒和细胞碎片。
注意事项：避免滤膜堵塞，可先用粗孔径滤膜（如0.8 μm）预过滤。
3. 病毒浓缩
常见的病毒浓缩方法：
超速离心（Ultracentrifugation）：
使用蔗糖或碘化钠梯度离心（如25,000-50,000 g，2-3小时），可获得高纯度病毒颗粒。
缺点是操作繁琐，容易造成病毒失活。
超滤浓缩（Centrifugal Filter Units）：
利用超滤离心柱（如10 kDa或100 kDa截断）浓缩病毒，操作简便，适用于实验室规模。
PEG沉淀（Polyethylene Glycol Precipitation）：
用PEG（8%-10%）沉淀病毒，优点是成本低，操作简单，但可能影响纯度。
4. 去除杂质
密度梯度离心：蔗糖或OptiPrep梯度离心可进一步纯化病毒，去除蛋白质、核酸等污染物。
柱层析：使用层析柱（如阴离子交换柱）进行病毒纯化，适合工业化生产。
透析：去除盐分、小分子杂质和PEG残留，保护病毒活性。
5. 病毒保存
储存条件：将纯化后的病毒分装，避免反复冻融。一般保存在-80℃，短期可置于4℃。
6. 病毒滴度检测
纯化完成后需检测病毒滴度：
功能滴度（Transduction Units, TU/ml）：通过感染靶细胞并测定GFP、荧光素酶等报告基因的表达。
物理滴度（Physical Titer）：通过qPCR或ELISA检测病毒RNA或蛋白。
关键注意事项
1.操作时保持低温：病毒颗粒对高温敏感，操作需在冰浴或4℃环境下进行。
2.防止污染：病毒纯化过程中需使用无菌器材，避免细菌、真菌等污染。
3.样本稳定性：收集上清液后尽快处理或置于-80℃保存，防止病毒滴度下降。
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