AAV（腺相关病毒）作为基因治疗中的常见病毒载体，其生产工艺主要包括以下几个关键步骤：
1. 质粒构建
重组质粒（载体质粒）：包含目的基因（转基因）和AAV的反向末端重复序列（ITRs）。
辅助质粒（帮助质粒）：提供AAV复制所需的辅助功能，通常包括腺病毒的辅助基因（如E2A、E4和VA基因）。
包装质粒：包含AAV衣壳蛋白（Cap）和复制蛋白（Rep）的编码序列。
质粒扩增与纯化：通过细菌扩增、提取和纯化高质量的质粒DNA，确保质粒DNA不含任何与工艺或产品相关的杂质。
2. 细胞培养
常用的AAV生产细胞系包括：
HEK293细胞（三质粒或两质粒共转染）
Baculovirus-Sf9昆虫细胞（使用杆状病毒系统）
稳定表达细胞系（如HeLa、HEK293衍生细胞，可提高批次间一致性）
细胞扩增通常采用摇瓶、细胞工厂或生物反应器（如悬浮培养）。
3. 细胞转染或感染
转染方法：将质粒混合后，通过转染试剂（如PEI或脂质体）转染到细胞中。对于大规模生产，悬浮生长的细胞（如悬浮适应的HEK293或Sf9昆虫细胞）比贴壁细胞更具优势。
转染完成后，细胞在培养基中继续培养约48-72小时，AAV病毒颗粒在细胞内合成并逐渐完成组装，最终累积在细胞中或培养上清中。
4. 病毒收获
收获方式取决于生产系统：
贴壁细胞（HEK293）：收集培养液并裂解细胞（冻融、超声或化学裂解）
悬浮细胞（Sf9或HEK293悬浮株）：直接从培养液收获病毒
为了释放AAV，通常采用超声波、冻融等裂解细胞。
5. 纯化
AAV纯化是关键步骤，涉及多个层级：
PEG沉淀或层析浓缩（去除大部分杂质）
层析纯化（包括层析柱技术）
- 阴离子交换层析（IEX）：去除宿主细胞蛋白
- 亲和层析（Affinity, 如AVB Resin）：高效富集AAV
超滤浓缩与缓冲液置换（通过超滤柱进行终浓缩，换成最终储存液）。
6. 质量控制
AAV产品在放行前需进行严格的质量控制，包括：
滴度测定（qPCR/ddPCR测定基因组拷贝数）
纯度分析（SDS-PAGE, HPLC等）
空壳率检测（AUC、ELISA）
内毒素检测
宿主DNA/RNA残留（qPCR检测）
7. 病毒储存
储存条件：纯化后的AAV病毒载体通常储存于低温（-80°C）条件下，以保持其感染活性和稳定性。