Nat Biomed Eng | Prime编辑结合多种递送策略治疗苯丙酮尿症

用瞬时引物编辑方法治疗小鼠代谢性肝病

研究概述

2025年5月20日，苏黎世大学Gerald Schwank教授团队在Nature Biomedical Engineering期刊发表标题为“Treatment of a metabolic liver disease in mice with a transient prime editing approach”的研究论文，该研究主要开发了一种基于瞬时Prime编辑技术的基因治疗策略，通过脂质纳米颗粒（LNP）递送Prime编辑器mRNA和gRNA，成功纠正了苯丙酮尿症（PKU）小鼠模型中的致病突变，并显著降低了血液中苯丙氨酸水平，为遗传性肝脏疾病的治疗提供了新的高效平台。

本研究使用了Pah enu2小鼠模型，该模型携带一个点突变（c.835T>C；p.F263S），该突变破坏了PAH的功能，并导致Phe水平从60 µmol l−1升高到1,500 µmol l−1。Richards等人曾尝试利用CRISPR-Cas9核酸酶和规律间隔短回文重复序列（CRISPR）来纠正这种代谢性肝脏疾病，但由于肝脏中同源定向修复（HDR）的频率较低，只有1%的肝细胞被纠正，高苯丙氨酸血症也未能得到解决。为了避免HDR的需求，作者和其他研究者之前曾使用碱基编辑来修复致病的PKU突变，并实现了降低Phe水平的治疗效果。然而，尽管碱基编辑在PKU患者的临床应用中具有潜力，但该技术主要限于修复转换点突变，排除了其他类型突变的患者。

与碱基编辑类似，Prime编辑技术可以在不需要HDR的情况下精确修复突变。Prime编辑器（PE）由H840A SpCas9切口酶（nCas9）与改造的莫洛尼氏小鼠白血病病毒（M-MLV）逆转录酶融合而成（此后称为PE2）。该复合体由Prime编辑引导RNA（pegRNA）引导至目标位点，pegRNA包含逆转录酶模板（RTT）和与引导RNA骨架3′端融合的引物结合位点。nCas9介导的非靶标DNA链切口和引物结合位点的杂交使得逆转录酶能够以RTT序列为模板延长3′ DNA末端。成功将生成的3′片段整合到目标位点中即可实现预期的编辑。因此，Prime编辑能够引入理论上任何小型遗传变化。

近期多项研究已证明Prime编辑在肝脏中的体内概念验证。然而，在使用RNA–LNP传递PE和pegRNA的瞬时Prime编辑方法中，编辑效率仍然较低（即使重新给药，Pcsk9位点的编辑效率仍低于8%）。尽管在通过病毒载体传递PE的研究中实现了更高的编辑效率，但PE的永久表达可能会给临床应用带来挑战，因为它增加了意外引入非靶标突变的可能性，并可能触发T细胞介导的清除持续表达基因编辑器的编辑细胞。

在本研究中，作者开发了肝脏瞬时Prime编辑策略，通过LNP封装的mRNA传递PE。使用腺相关病毒（AAV）表达pegRNA时，作者在Dnmt1位点实现了高达47.4%的编辑效率，在Pah enu2位点实现了20.7%的编辑效率。当以合成的化学修饰RNA形式共传递pegRNA时，编辑效率分别达到了35.9%和8.0%。两种传递方法均成功将Phe水平降低至360 µmol l−1的治疗阈值以下，展示了mRNA–LNP介导的Prime编辑方法在纠正遗传性肝脏疾病中的潜力。

在早期研究中，作者尝试利用AAV介导的intein分裂PE2和靶向Pah enu2的pegRNA来纠正Pah enu2小鼠模型中的致病突变，但校正率低于1%，且仅在使用腺病毒载体以临床上不可行的剂量时才取得成功。因此，作者尝试通过改进Prime编辑技术来提高校正率。

作者将PE2替换为PEmax，并在pegRNA的3′端加入伪结结构以防止外切酶降解，同时在PAM的GG序列中引入沉默突变以防止编辑后的位点被重新靶向。这些改进显著提高了校正率，并将插入-缺失（indel）率降低到背景水平（图1a-c）。

随后，作者利用AAV载体将优化后的PE组分（PEmax + tevopreQ1-mPKU-SM）传递到Pah enu2小鼠体内。由于PE的大小超出了AAV的包装能力，作者采用intein分裂系统将Cas9分割开来，并从两个独立的AAV中表达PE。

重组AAV2基因组被包装进肝脏趋向性的AAV9衣壳中，并通过尾静脉以每公斤1×10¹⁴vg的剂量系统性地注射到小鼠体内（图1e）。7周后，通过下一代测序（NGS）分析分离的肝细胞，发现Pah enu2突变的校正率达到4.6%，血液中苯丙氨酸（Phe）水平从超过1,500 µmol l⁻¹降低到623.7 µmol l⁻¹（图1f和图1g）。编辑主要局限于肝细胞，且未在非靶标位点检测到意外编辑。

图1. 使用AAV介导的intein分裂PEmax进行Pahenu2小鼠的体内校正。

2. 使用LNP介导的RNA递送进行肝脏Prime编辑

尽管优化后的AAV载体和Prime编辑组分显著提高了Pah enu2的校正率，但仍未能将苯丙氨酸（Phe）水平降低至治疗阈值以下。此外，高剂量AAV（1×10¹⁴ vg kg⁻¹）可能引发严重免疫反应，且长期表达PE可能导致非靶标突变积累或免疫反应。

为了探索更安全的递送方式，作者尝试了LNP介导的mRNA和pegRNA递送。研究发现，在系统性注射2 mg kg⁻¹的mRNA–LNP后，PE mRNA和蛋白水平分别在6小时和24小时达到峰值，45小时后不再可检测（图2a）。作者合成了靶向Pah enu2位点和Dnmt1位点的pegRNA，并通过化学修饰保护其免受外切酶和内切酶降解。在HEK细胞中共电转染PEmax mRNA和pegRNA后，Pah enu2位点和Dnmt1位点的编辑效率分别为25%和37%（图2b）。

然而，在小鼠中采用重复给药方案（先注射PEmax mRNA，14小时后注射pegRNA）时，编辑效率仍然较低：Dnmt1位点为1.4%，Pahenu2位点为0.4%（图2c和图2d）。进一步实验表明，同时注射mRNA–LNP和pegRNA–LNP的小鼠编辑效率最高（单剂量后3.5%，5天后重新给药后达到10.5%；图2e和图2f）。但即使在5天间隔内重新给药三次，编辑效率仍仅为0.1%。这表明，尽管LNP介导的RNA递送具有潜力，但当前的给药方案仍需优化以提高编辑效率。

图2. 使用RNA-LNP递送的体内引物编辑

3. 使用PEmax mRNA–LNP进行Pahenu2小鼠的体内校正

作者推测，RNA–LNP方法中Prime编辑效率可能受限于pegRNA的低丰度和快速降解。因此，作者尝试了一种替代策略：仅通过mRNA–LNP瞬时传递PE，而pegRNA则通过AAV传递。

PKU小鼠首先接受2.5×10¹³ vg kg⁻¹的scAAV2/9处理，编码tevopreQ1-mPKU-SM pegRNA，随后接受3 mg kg⁻¹的PE2或PEmax mRNA–LNP治疗（图3a）。结果显示，在Dnmt1位点，PE2的编辑率为17.7%，PEmax的编辑率达到了26.2%（图3b和图3c），而在Pahenu2位点，编辑率较低（PE2为1.1%，PEmax为1.0%）。即使在PE传递后4个月，编辑率也未下降，表明编辑效果持久。

此外，降低scAAV2/9剂量至1×10¹² vg kg⁻¹或mRNA–LNP剂量至2 mg kg⁻¹时，编辑效率也未显著下降（图3d和图3e）。作者还尝试通过共传递VPX mRNA来提高脱氧核糖核苷三磷酸水平，但未观察到编辑效率的提升（图3e）。

图3. 使用 pegRNA-AAV 和 PE mRNA-LNP 进行体内引物编辑

为了进一步提高Pah enu2位点的编辑率，作者对经过pegRNA-AAV预处理的PKU小鼠进行了三次2 mg kg⁻¹ mRNA–LNP的重新给药（图4a）。

结果显示，PE2的编辑率最高达到6.2%（平均2.9%），PEmax的编辑率最高达到8.7%（平均4.3%；图4b），成功将血液中Phe水平降低到600 µmol l⁻¹以下，并显著提高了肝脏中PAH酶的活性（图4c–e）。这表明，通过优化给药方案，Prime编辑在体内校正Pahenu2突变方面具有显著潜力。

图4. 使用pegRNA-AAV和PEmax mRNA–LNP对Pahenu2小鼠进行体内校正

4. 使用PE7 mRNA–LNP进行Pahenu2小鼠的体内校正

为了将苯丙氨酸（Phe）水平降低至儿童和孕妇的安全阈值（360 µmol l⁻¹）以下，作者尝试通过设计新的pegRNA和使用新型PE7编辑器来提高Pahenu2等位基因的校正效率。尽管新的pegRNA在体外和体内实验中并未显著提高编辑效率，但PE7的使用显著提升了编辑效率。

在使用2.5×10¹³ vg kg⁻¹的scAAV2/9预处理后，PE7在Dnmt1位点实现了47.4%的编辑效率（图5a），在Pahenu2位点实现了20.7%的编辑效率（图5b），成功将Phe水平降低至360 µmol l⁻¹以下（图5c）。

图5. 使用pegRNA-AAV和PE7 mRNA–LNP在Dnmt1位点进行体内Prime编辑及校正Pahenu2小鼠

进一步评估PE7在全RNA–LNP递送系统中的效果时，PE7 mRNA与合成的La可结合pegRNA联合使用。在Dnmt1位点，使用2 mg kg⁻¹ PE7 mRNA–LNP和2 mg kg⁻¹ pegRNA–LNP（两次给药，间隔5天）实现了35.9%的编辑效率（图6a），比PEmax的全RNA–LNP递送系统提高了3.4倍（图2f）。在Pah enu2位点，使用2 mg kg⁻¹ PE7 mRNA–LNP和2 mg kg⁻¹ pegRNA–LNP（三次给药，间隔5天）实现了8.0%的校正效率（图6b），显著高于PEmax的0.5%（图2d和图2f），并将Phe水平降低至342 µmol l⁻¹。

此外，作者还测试了PE7对其他11种常见PKU突变的编辑效率，发现其中8种突变的编辑效率高于Pah enu2突变（图6d），表明PE7 mRNA–LNP在PKU治疗中具有广阔的应用前景。

图6. 使用全RNA–LNP递送在Dnmt1位点进行体内Prime编辑及校正Pahenu2小鼠

5. Prime编辑未引起非靶标编辑或肝脏损伤

作者通过从不同器官分离DNA并利用NGS分析，评估了双AAV–LNP和全RNA–LNP方法的Prime编辑是否局限于肝脏。结果显示，在Pah enu2靶向或Dnmt1靶向的小鼠中，其他组织未观察到显著编辑（图7a、d）。进一步对两种pegRNA的前五个非靶标结合位点进行靶向扩增子测序，也未发现超出背景水平的编辑（图7b、c、e、f），表明Prime编辑具有较高的靶标特异性。

作者还检查了mRNA–LNP、pegRNA–LNP或pegRNA-AAV的递送是否引发肝脏毒性或免疫反应。结果显示，给予2 mg kg⁻¹的PE mRNA–LNP或pegRNA–LNP后6小时，ALT水平轻度升高，但在45小时或1周后恢复至基线（图7g、h）。促炎细胞因子（如MCP1和IFNγ）也仅出现短暂增加，随后恢复正常（图7i–l）。

此外，以2.5×10¹³ vg kg⁻¹剂量给予编码pegRNA的scAAV2/9时，未观察到ALT、AST或促炎细胞因子的显著增加（图7g–l）。组织学检查也未发现经处理小鼠肝脏有明显坏死迹象。这些结果表明，Prime编辑在体内应用中具有良好的安全性和耐受性。

图7. 评估接受pegRNA-AAV和mRNA–LNP治疗的小鼠的非靶标效应和肝脏毒性

早期研究表明，通过病毒载体介导的Prime编辑器（PE）传递，可以在体内校正PKU小鼠模型。然而，编辑工具的长期表达给这些方法的临床应用带来了限制。碱基编辑技术虽然通常比Prime编辑更高效，但大多数致病性PKU突变无法通过当前的碱基编辑器进行靶向，因为这些突变不是转换点突变，或者在编辑窗口内存在额外的目标碱基，可能导致不良的旁观者突变。另一种可能的替代方法是使用AAV载体进行经典的基因添加疗法，将功能性Pah基因传递到肝细胞中。尽管这种方法在PKU小鼠中显著降低了苯丙氨酸（Phe）水平，但由于AAV载体的游离性质以及肝细胞在组织稳态和再生过程中的分裂，该方法可能无法提供永久性治愈。

在本研究中，作者开发了两种短暂的体内Prime编辑方法来纠正小鼠的PKU。最初，作者通过LNP将合成的pegRNA与PEmax mRNA一起传递到肝脏。在Dnmt1位点，这种方法在单剂量或两剂量的RNA–LNP后，分别在肝细胞中实现了3.5%和10.5%的编辑效率。然而，在Pahenu2位点，编辑效率显著较低（<0.5%），无法将Phe降低到治疗水平。

因此，作者测试了一种双AAV–LNP方法，即pegRNA通过AAV永久表达，而PE则通过mRNA–LNP短暂传递。这种方法显著提高了编辑效率，在Dnmt1位点单剂量mRNA–LNP后实现了26.2%的编辑，在Pah enu2位点三剂量mRNA–LNP后实现了4.3%的编辑。尽管Pah enu2位点的编辑率足以将Phe水平降低到成人治疗阈值（600 µmol l⁻¹）以下，但仍未达到儿童治疗阈值（360 µmol l⁻¹）。

这促使作者测试了新型PE7 PE变体，该变体将小RNA结合核酸酶保护因子La与逆转录酶融合，以进一步提高编辑率。使用PE7 mRNA–LNP的双AAV–LNP方法在Dnmt1位点单剂量后实现了47.4%的编辑，在Pah enu2位点三剂量后实现了20.7%的校正，足以将Phe水平降低到360 µmol l⁻¹以下。

在PEmax的全LNP方法中，作者使用了已经通过化学修饰在5′和3′端保护免受核酸酶降解的pegRNA。然而，这些修饰并不一定完全有效，Yan等人推测，除了保护免受核酸酶降解外，La还可以增强pegRNA的核保留，并促进pegRNA在Cas9上的装载。因此，作者测试了当PE7 mRNA与La可及的合成pegRNA共传递时，是否也能提高Prime编辑效率。值得注意的是，这种策略在Dnmt1位点两剂量RNA–LNP后实现了35.9%的编辑，在Pah enu2位点三剂量RNA–LNP后实现了8.0%的编辑，并将Phe水平降低到360 µmol l⁻¹以下。

总之，本研究提出了两种不同的肝脏短暂Prime编辑策略。在第一种方法中，pegRNA通过AAV永久表达，而PE通过mRNA–LNP短暂传递。在第二种方法中，pegRNA和PE mRNA都通过LNP短暂传递。尽管双AAV–LNP方法需要患者暴露于两种不同的传递载体，但在使用等量的mRNA–LNP时，它实现了显著更高的编辑效率。在Pah enu2 PKU小鼠模型中，全LNP方法中使用PE7实现了足够的校正效率，将Phe水平降低到治疗阈值以下，且在K562报告细胞系中比较Prime编辑效率表明，这种方法也可能对其他人类致病性PKU突变有效。鉴于这些结果，双AAV–LNP方法可能不是PKU的最佳选择。然而，对于需要更高编辑效率的遗传性疾病，双AAV–LNP方法可能是一个可行的替代方案。未来的研究将对确定这种双载体策略是否必要，或者全LNP方法是否可以进一步优化以提高编辑效率至关重要，从而扩大其对更广泛遗传性疾病的治疗潜力。