基因剪刀的“遥控开关”：AAV-Cre/LoxP系统

2025年9月8日

在基因功能研究的工具箱里，Cre-LoxP系统无疑是那把最锋利的“瑞士军刀”。但如何才能真正驾驭它？当它与腺相关病毒(AAV）这个高效的“快递员”相遇，又将释放出怎样的潜力？无论您是初识Cre-LoxP的新手，还是希望优化实验方案的资深研究者，本文都将为您提供一份从原理到实践的详尽指南。

一、什么是Cre-LoxP？

1.Cre和LoxP：系统的两大核心元件

Cre重组酶（Cyclization recombination）

Cre重组酶(38kDa)是一种源自于P1噬菌体的“分子剪刀”（蛋白酶），可以特异性识别并催化LoxP位点间的DNA重组，其特点是不需要辅助因子，能在多种细胞类型和物种中高效工作。

LoxP位点（Locus of X-over in P1）

一段34bp的DNA序列，包含两个13bp的反向回文序列，中间夹着一个8bp的间隔区（决定方向性）。它就像是贴在DNA上的“剪切在此”的标签，为Cre“剪刀”指明工作位置。

2. 重组机制

Cre重组酶通过以下步骤催化DNA重组：

1）识别：Cre重组酶单体识别并结合到每个LoxP位点

2) 四聚体形成：两个LoxP位点的Cre单体形成四聚体复合物

3) 切割：Cre在每个LoxP位点的8bp间隔区两侧切割DNA

4) 交换：DNA链交换并重新连接

5) 释放：重组后的DNA从Cre四聚体释放

重组结果取决于两个LoxP位点的相对方向和位置（图1）： 20250908095212

图1 Cre-LoxP四种经典重组模式示意图[1]

3. 常用策略

LSL系统（Lox-Stop-Lox）

在实际应用中，LSL策略（图2）应用最为广泛。

结构：在目标基因前插入被同向LoxP位点包围的转录终止序列

初始状态：终止序列阻断下游基因表达

Cre介导重组后：终止序列被删除，目标基因得以表达

应用：条件性基因激活，如肿瘤模型中的致癌基因激活

图2 CRE重组酶介导的Lox-Stop-Lox基因激活[2]

DIO(Double-floxed Inverse Orientation)系统

DIO提供更严格的基因表达控制（图3）。

结构：目标基因以反向构建在两对反向排列的LoxP位点之间

初始状态：反向插入的基因不产生功能性蛋白

Cre介导重组过程：1) 无Cre存在时，反向插入的基因不产生功能性蛋白；2）Cre存在时，先通过一次重组将基因翻转至正确方向；3）第二次重组后，基因被”锁定”在正确方向，实现稳定表达

优势：显著降低背景表达，特别适用于神经科学等需要高度特异性的研究

图3 DIO系统实现Cre依赖不可逆基因表达的示意图[3]

二、强强联合：为什么用AAV递送Cre-LoxP

传统上，要让Cre酶和LoxP位点在小鼠体内相遇，需要通过繁琐的转基因小鼠杂交，过程漫长且成本高昂。而AAV的出现，彻底改变了游戏规则。

AAV是一种安全、高效的病毒载体，像一个“快递员”，可以把我们想要的基因（比如Cre基因）精准地“派送”到特定组织、特定细胞中。

相比传统杂交，用AAV递送Cre-LoxP具有显著优势，可总结为“快、准、省”：

快：节省数月的实验周期

传统杂交：获得理想的实验动物至少需要3-6个月。

AAV递送：只需2-4周，即可在现成的floxed小鼠上开展实验。

准：实现前所未有的时空精度

时间精准：可在动物的任何发育阶段（如成年后）进行注射，避免胚胎期基因敲除可能带来的发育问题或致死效应。

空间精准：通过脑立体定位注射、局部给药等方式，可以实现对特定脑区、甚至单侧组织的精准基因编辑，另一侧则可作为完美的自身对照。

省：大幅降低成本和动物使用量

无需维持和繁育大量的转基因鼠群，显著节约了饲养成本和宝贵的实验动物资源。

20250908095304

三、**AAV-Cre vs. AAV-LoxP，我该怎么选？**

在实验设计中，一个常见的问题是：我应该用AAV递送Cre，还是递送LoxP？这取决于你手头已有的“材料”。

实验一：已有Floxed小鼠，选择AAV-Cre

你的小鼠：基因组的特定基因两侧已经被插入了LoxP位点（我们称之为Floxed小鼠）。这个基因目前是正常的。

你的工具：选择AAV-Cre。

工作流程：

1）选择一个合适的AAV血清型（决定病毒的组织亲和性）。

2）选择一个合适的启动子（决定Cre酶在哪些细胞类型中表达）。

3）将包装好的AAV-Cre病毒注射到Floxed小鼠的目标组织（如海马体、肝脏）。

4）AAV感染细胞后，表达出Cre“剪刀”，对带有LoxP的基因进行“剪切”（敲除或激活），从而实现组织特异性的基因编辑。

实验二：已有Cre小鼠，选择AAV-DIO/FLEX

你的小鼠：能在特定细胞类型中（例如，多巴胺能神经元）表达Cre酶（我们称之为Cre driver小鼠）。

你的工具：选择包含AAV-DIO-基因X或AAV-FLEX-基因X的载体。

工作流程：

1）设计一个AAV载体，其中你的目标基因X（如ChR2、EGFP）被DIO或FLEX结构“锁住”。

2）将此AAV病毒注射到Cre小鼠的目标组织。

3）只有在那些表达Cre酶的细胞里，这个被“锁住”的基因X才会被“解锁”和翻转，并开始表达。在其它没有Cre的细胞里，则完全没有表达。

这种策略实现了极高的细胞类型特异性，是神经环路研究、细胞功能研究的利器。

四、如何定制你的专属“快递”？AAV设计三步法

一个成功的AAV-Cre/LoxP实验，离不开精心的载体设计。以下“三步法”将帮助你做出关键决策：

第一步：选择血清型——决定“去往何处”

AAV有多种不同的“外壳”，即血清型，它们决定了病毒更容易感染哪些组织（组织嗜性）。

派真生物可以为您提供以下AAV血清型：

20250908095314

第二步：选择启动子——决定“在哪里”表达

启动子是基因表达的“开关”，它决定了Cre酶或你的目标基因在哪种类型的细胞中表达。

广谱启动子 (CAG, CMV)：表达强，几乎在所有细胞中都表达。适用于需要高效重组的场景。

组织特异性启动子 (TBG-肝脏, cTnT-心脏)：只在特定器官中开启表达。

细胞类型特异性启动子 (hSyn-神经元)：实现更精细的细胞定位，是神经科学研究的首选。

策略：优先选择文献中已验证过的“血清型+启动子”组合。同时注意启动子的大小，确保能被AAV载体（容量约4.7kb）装下。

派真生物可以为您提供以下组织/细胞特异性启动子：

20250908095323

第三步：优化病毒剂量——平衡“效率”与“安全”

病毒剂量不是越高越好。过高的Cre表达可能对细胞产生毒性。

低剂量 (1E+9-1E+10 vg)：适用于表达效率高的启动子或敏感组织，能最小化毒性。

中高剂量 (1E+10-1E+12 vg)：适用于大多数常规实验，是平衡效率与安全性的理想起点。

策略：建议进行预实验，从小剂量开始，通过报告基因（如EGFP）评估不同剂量下的重组效率和细胞毒性，找到最佳的“窗口”。

20250908095332

五、应用实例：见证AAV-Cre/LoxP的力量

1. 神经元稀疏标记（sparse labeling）

20250908095347

在这篇文章中，研究者使用了 AAV-hSyn-Cre和 AAV-hSyn-DIO-tdTomato两种AAV工具病毒，进行稀疏标记实验，以研究 Mef2cL35P 突变对小鼠内侧前额叶皮层（mPFC）II/III 层锥体神经元树突棘发育的影响[4]。

实验设计与原理：

AAV-hSyn-Cre：在神经元中表达 Cre 重组酶，由 hSyn（人突触素启动子）驱动，特异性靶向神经元。

AAV-hSyn-DIO-tdTomato：含有双重倒置开放阅读框（DIO），只有在 Cre 存在时，tdTomato 红色荧光蛋白才会被表达。

两者联合使用时，只有共感染了 Cre 和 DIO-tdTomato 的神经元才会发出红色荧光，实现稀疏、清晰、单个神经元级别的标记。

实验操作：

将AAV-hSyn-Cre（0.05 μL，滴度为1–1.25×10¹³ vg/mL）与AAV-hSyn-DIO-tdTomato（0.05 μL，滴度为2.9×10¹² vg/mL）混合后，通过脑立体定位注射至小鼠双侧内侧前额叶皮层（mPFC）（原文图5）。感染后约 4 周，取脑切片，观察 II/III 层锥体神经元的树突结构。使用高分辨率共聚焦显微镜成像，定量分析树突棘密度和形态。

实验结果：

Mef2cL35P^+/-小鼠的蘑菇状和总树突棘密度显著低于野生型（WT）小鼠。

经过 AeCBE 碱基编辑治疗后，树突棘密度显著恢复，接近 WT 水平。

原文图5 在 aecbe 编辑后

原文图5 在 AeCBE 编辑后，Mef2cL35P^+/− 小鼠内侧前额叶皮层II/III 层神经元树突棘密度及突触传递功能的恢复情况。a 示意图：通过立体定位注射对Mef2c 野生型（WT）或 L35P^+/− 小鼠 mPFC II/III 层锥体神经元进行稀疏标记。b 稀疏标记后 mPFC II/III 层锥体神经元的代表性图像。c AAV-EGFP 处理的 Mef2c WT 小鼠以及分别注射 EGFP 或 AeCBE 的 Mef2cL35P^+/− 小鼠的原代皮层神经元树突代表性图像。d、e mPFC II/III 层锥体神经元主树突的蘑菇状（d）及总树突棘密度（e）定量分析。f mPFC II/III 层神经元微小兴奋性突触后电流（mEPSC）与微小抑制性突触后电流（mIPSC）的代表性电生理记录迹线。g mEPSC 频率定量。h mEPSC 振幅定量。i mIPSC 频率定量。j mIPSC 振幅定量。

2．用于操控神经元活动

20250908095426

在这篇文章中，研究者使用了AAV-retro-Cre-mCherry（逆行病毒）+ AAV-CAG-DIO-GtACR1（ArchT 类光抑制病毒）进行光遗传学抑制实验，以研究AHN^Vgat+神经元在焦虑和防御行为中的因果作用，特别是在面对陌生物体或高架十字迷宫开放臂这类“潜在威胁”情境下，AHN^Vgat+神经元是否是驱动回避行为所必需的[5]。

实验设计：

病毒注射：将AAV-retro-Cre-mCherry注入 AHN（目标脑区），用于标记投射到 AHN 的 vSub 神经元；将AAV-CAG-DIO-GtACR1注入 vSub（腹侧下托），通过这种组合，只有那些投射到 AHN 的 vSub 神经元才会被 retro-Cre 标记，从而驱动 GtACR1 表达，实现对这些特定投射神经元的光遗传抑制。

光纤植入：在 AHN 上方植入光纤，用于蓝光（473 nm）照射，实时抑制 AHNV^gat+神经元活动。

行为测试：开放场 + 陌生物体实验观察小鼠是否因 AHN^Vgat+神经元被抑制而减少对陌生物体的回避。

高架十字迷宫（EPM）实验：观察小鼠是否因 AHN^Vgat+神经元被抑制而减少对开放臂的回避。

实验结果：

抑制 AHNV^gat+神经元后，小鼠显著减少对陌生物体的回避行为（更多时间靠近物体）（原文图7）。在高架十字迷宫中，小鼠显著增加进入开放臂的时间和探索行为。

原文图7 抑制投射至ahn的腹侧下托（vsub）神经元可减少焦虑样回避行为

原文图7 抑制投射至AHN的腹侧下托（vSub）神经元可减少焦虑样回避行为。a 示意图：采用逆向标记策略，双侧抑制投射至AHN的 vSub 神经元。b 代表性图像：vSub 中 GtACR1 表达（上），AHN 中 retro-Cre 表达（下）。c、d 代表性记录（c）与定量（d）：蓝光脉冲（473 nm，20 ms，20 Hz）可急性且可逆地抑制表达 GtACR1 细胞的放电。e–h 开放场实验中，抑制投射至 AHN 的 vSub 神经元。i–k 高架十字迷宫（EPM）实验中抑制投射至 AHN 的 vSub 神经元。

3. 用于条件性基因敲除

20250908095447

在这篇文章中，研究者使用 AAV2-hSyn-mCherry-2A-Cre-WPRE-SV40A 病毒对背侧中缝核（DRN）中雌激素受体2（Esr2）进行了条件性敲除，以研究Esr2对情绪行为的性别差异调控作用[6]。

实验设计：

将 AAV2-hSyn-mCherry-2A-Cre-WPRE-SV40A 病毒直接注射到 Esr2^fl/fl小鼠的DRN（原文图3），利用病毒携带的 Cre 重组酶在局部切除Esr2基因的第三外显子，从而实现该脑区Esr2的条件性敲除；对照组则注射不含 Cre 的 AAV2-hSyn-mCherry 病毒，仅表达红色荧光蛋白。病毒注射后 3 周，所有动物依次接受开放场（OF）、高架十字迷宫（EPM）和尾悬吊（TST）三项行为学测试。

实验结果：

在开放场测试中，Cre 病毒介导的 DRN-Esr2缺失使雌性小鼠在中心区域停留的时间显著减少，提示焦虑水平升高；而雄性小鼠的中心停留时间未受影响，表明该效应具有雌性特异性。在高架十字迷宫实验里，无论雌雄，敲除Esr2均不改变小鼠在开放臂的探索时间，提示 DRN-Esr2 对主动回避情境下的焦虑行为影响有限。尾悬吊实验则显示，DRN-Esr2缺失显著缩短了小鼠的不动时间，呈现抗抑郁样作用，且这一效应在雄性个体中更为明显。

综上，该研究利用 AAV-Cre 病毒精准敲除 DRN-Esr2，揭示了其在雌性中发挥抗焦虑功能、在雄性中则主要发挥抗抑郁作用，从而阐明了雌激素受体调控情绪行为的性别差异机制。

原文图3 针对背侧中缝核（drn）esr2的条件性敲除

原文图3 针对背侧中缝核（DRN）Esr2的条件性敲除。A 病毒注射策略示意图。B 行为测试时间线及实验分组示意图。C 代表性图像显示注射指定病毒后，不同基因型动物 DRN 内 mCherry 的表达情况（上图）。D DRN内病毒扩散体积的定量分析。E Cre 介导的 Esr2 缺失示意图，并标注用于检测缺失事件的 PCR 引物。F 使用引物对 p1 和 p5 对 DRN 脑区提取的基因组 DNA 进行 PCR 分析。G 高倍镜下展示图 C 中白框区域：mCherry（红色）与 Esr2 RNAscope 信号（绿色）共定位，并用 DAPI（蓝色）复染。H mCherry⁺细胞中 Esr2 与 mCherry 双阳性细胞百分比统计。

结语

AAV-Cre/LoxP系统是现代基因功能研究的基石，它将基因编辑的精度和灵活性提升到了一个前所未有的高度。通过理解其核心原理，掌握AAV的设计策略，科研人员就能够根据自己的实验需求，设计出最精准、高效的实验方案，从而加速对生命奥秘的探索。

常见“张冠李戴“误区及澄清

1. 误区：认为AAV-Cre携带LoxP位点

澄清：AAV-Cre仅携带Cre基因，LoxP位点存在于宿主基因组

2. 误区：认为AAV-LoxP递送Cre酶

澄清：AAV-LoxP携带被LoxP包围的目标基因，依赖宿主细胞内源Cre

3. 误区：混淆Cre依赖性表达载体(如AAV-DIO)与AAV-Cre

澄清：前者携带被LoxP修饰的目标基因，后者携带Cre基因本身

派真生物重组酶系列AAV现货产品列表（部分）

20250908095515 20250908095523

参考文献：

[1] Tian, X. and B. Zhou, Strategies for site-specific recombination with high efficiency and precise spatiotemporal resolution. J Biol Chem, 2021. 296: p. 100509.

[2] Alcoser, Sergio Y, M. G. Genetically Engineered Mouse Models in Preclinical Anti-Cancer Drug Development. SN: 978-953-307-615-7. Doi: 10.5772/30666. 2011

[3] Atasoy, D., et al., A FLEX switch targets Channelrhodopsin-2 to multiple cell types for imaging and long-range circuit mapping. J Neurosci, 2008. 28(28): p. 7025-30.

[4] Li, W.K., et al., Whole-brain in vivo base editing reverses behavioral changes in Mef2c-mutant mice. Nat Neurosci, 2024. 27(1): p. 116-128.

[5] Yan, J.J., et al., A circuit from the ventral subiculum to anterior hypothalamic nucleus GABAergic neurons essential for anxiety-like behavioral avoidance. Nat Commun, 2022. 13(1): p. 7464.

[6] He, J., et al., Sexually dimorphic effects of estrogen receptor 2 deletion in the dorsal raphe nucleus on emotional behaviors. J Neuroendocrinol, 2023. 35(2): p. e13195.

关于派真

作为一家专注于AAV 技术十余年，深耕基因治疗领域的CRO&CDMO，派真生物可提供从载体设计、构建到 AAV、慢病毒和 mRNA 服务的一站式解决方案。凭借深厚的技术实力、卓越的运营管理和高标准的服务交付，我们为全球客户提供一站式CMC解决方案，包括从早期概念验证、成药性评估到IIT、IND及BLA的各个阶段。

凭借我们独立知识产权的π-alpha^TM 293 细胞AAV高产技术平台，我们能将AAV产量提高多至10倍，每批次产量可达1×10¹⁷vg，以满足多样化的商业化和临床项目需求。此外，我们定制化的mRNA和脂质纳米颗粒（LNP）产品及服务覆盖药物和疫苗开发的各个阶段，从研发到符合GMP的生产，提供端到端的一站式解决方案。