AAV小鼠实验中常见的问题

一、病毒载体相关的问题

1. 病毒滴度不准或过低

   • 问题：注射后没有表达，或表达水平极低，无法达到实验要求。

   • 原因：

     • 病毒储存不当（反复冻融、未在-80℃保存）。

     • 滴度测定方法不准确（物理滴度vs.功能滴度）。

     • 病毒本身质量差，生产过程中滴度损失大。

   • 解决方案：

     • 分装保存病毒，避免反复冻融（通常冻融不超过3次）。

     • 使用功能性滴度测定（如qPCR测基因组滴度）而非仅凭物理滴度。

2. 病毒纯度低

   • 问题：注射后引起强烈的免疫反应或炎症，导致神经元死亡或非特异性效应，混淆实验结果。

   • 原因：病毒制备过程中残留的细胞碎片、包装质粒、内毒素等杂质。

   • 解决方案：

     • 选择经过纯化（如氯化铯梯度离心或柱色谱法）的病毒 prep。

     • 检测内毒素水平，选择内毒素含量低的病毒。

3. 血清型选择不当

   • 问题：无法有效感染靶细胞（如神经元），或感染了非靶向细胞（如胶质细胞）。

   • 原因：不同AAV血清型（如1, 2, 5, 6, 8, 9, DJ, PHP.eB, PHP.S等）对不同细胞类型的嗜性（Tropism）不同。

   • 解决方案：

     • 查阅最新文献，选择对目标细胞类型嗜性最佳且脱靶率最低的血清型。

     • 进行预实验，测试2-3种不同血清型的效果。

二、实验设计与操作问题

1. 注射部位不准确

   • 问题：表达不在目标脑区或器官，导致实验失败。

   • 原因：小鼠脑图谱坐标不准、操作技术不熟练、动物个体差异。

   • 解决方案：

     • 使用立体定位仪并进行严格校准。

     • 在注射前进行大量练习，熟练掌握操作。

     • 注射后可用染料（如快绿）或通过免疫组化验证注射位点。

2. 注射体积和速度不当

   • 问题：病毒液回流、组织损伤严重、扩散范围过大。

   • 原因：注射速度过快、体积过大（特别是对小脑区）。

   • 解决方案：

     • 使用纳米注射泵或UMP3等精密注射设备。

     • 控制注射速度。

     • 根据目标脑区大小选择合适的体积。

3. 表达时间不足

   • 问题：表达量低，检测不到信号。

   • 原因：AAV需要时间在细胞内解包、转录和翻译，达到峰值表达通常需要2-4周（取决于血清型和启动子）。

   • 解决方案：

     • 预留足够的表达时间。通常建议至少等待2周，对于某些启动子或血清型可能需要更久（3-4周）。

     • 在实验时间表中明确规划好表达时间。

三、生物学效应问题

1. 免疫反应

   • 问题：靶细胞被免疫系统清除，表达逐渐减弱或消失，动物出现病态。

   • 原因：

     • 小鼠对AAV衣壳或转基因产物（尤其是非自身蛋白，如opsin, DREADD, Cre酶）产生免疫应答。

     • 使用免疫缺陷鼠可缓解衣壳反应，但无法缓解对转基因产物的反应。

   • 解决方案：

     • 尽量使用物种特异性基因或隐藏性较好的蛋白。

     • 通过局部（脑内、腹腔）注射而非全身给药可降低免疫风险。

     • 使用对免疫原性较低的血清型（如AAV9）。

     • 在病毒构建中加入“自我沉默”的miRNA靶点序列，只在特定细胞中表达。

2. 细胞毒性

   • 问题：靶细胞死亡或功能失常，并非由实验处理而是由病毒或转基因本身引起。

   • 原因：

     • 外源基因过表达（如离子通道、毒性蛋白）本身对细胞造成负担。

     • 高病毒载量导致细胞应激。

   • 解决方案：

     • 进行剂量梯度测试，寻找有效且无毒的最低剂量。

     • 使用诱导型或组织特异性启动子（如Cre依赖性表达）以控制表达水平和时间。

3. 脱靶表达

   • 问题：在非目标细胞类型中也有表达，导致实验结果解释困难。

   • 原因：血清型选择不理想；启动子特异性不足（如普遍使用的CAG, CMV启动子很强但特异性差）。

   • 解决方案：

     • 使用特异性更高的启动子（如CaMKIIα for 兴奋性神经元，GAD67 for 抑制性神经元）。

     • 采用双病毒系统（如Cre-LoxP）实现更精确的靶向。

为了最大程度避免这些问题，一个成功的AAV实验应遵循以下流程：

1. 精心设计：选择正确的血清型、启动子和滴度。查阅文献是关键。

2. 质量控制：使用高纯度、高滴度、低内毒素的病毒，并妥善保存。

3. 熟练操作：在正式实验前进行大量的注射练习，确保定位准确、损伤最小。

4. 设置对照：必须包括空病毒载体对照组（只含启动子，不含目的基因）以排除病毒载体和操作本身的影响。

5. 验证表达：在行为学或电生理之前，用少量动物做免疫荧光、ISH 等确认表达位置、水平和特异性，能避免大批次实验的资源浪费。

6. 耐心等待：给予病毒足够长的表达时间。