跨BBB靶向ALPL受体的新型AAV载体，显著提升CNS递送效率

一、VCAP-102的发现：RNA引导的AAV定向进化

传统的AAV衣壳改造策略通常受限于种属特异性，在啮齿类动物中表现良好的改造型AAV，往往在灵长类动物中效果不佳，反之亦然。这种”种属壁垒”严重制约了AAV载体从动物模型到临床应用的转化。

Voyager Therapeutics公司的研究团队利用其专有的TRACER(Translationally Optimized Capsid Evolution via RNA)技术平台，在食蟹猴体内进行了AAV9衣壳的定向进化筛选。他们首先构建了AAV9″热点”文库，系统评估了AAV9衣壳表面不同位点对随机6肽插入的耐受性，发现位于衣壳三重轴尖峰的VR-IV区域（可变区域IV）高度适合肽插入，且不显著影响衣壳的组装和转导能力。基于这一发现，研究团队构建了针对VR-IV区域的随机肽插入文库，并经过在食蟹猴体内进行多轮筛选，最终分离获得了两个高性能变体：VCAP-101和VCAP-102（图1）。令人惊喜的是，这两个在灵长类动物中筛选出的变体，在小鼠中同样展现出优异的BBB穿透能力，这与以往的经验（啮齿类与灵长类之间存在种属特异性）形成鲜明对比。

这两个变体共享一个关键的氨基酸模体：丝氨酸-脯氨酸-组氨酸(SPH)，位于插入位点的456-458位，后面跟随一个带正电荷的氨基酸（赖氨酸K或精氨酸R）。冷冻电镜结构分析证实，这一插入肽位于AAV9衣壳VR-IV区域的顶端，形成了一个突出的结构域。

图1. 基于TRACER的体内筛选设计及最佳候选衣壳

(A) TRACER-NHP定向进化流程示意图。(B) 步骤(8)中在食蟹猴脑部富集度最高的100种衣壳的热图。色阶表示这100种衣壳在所示组织内相较于AAV9的mRNA富集分数。SC：脊髓。(C) 1,500种衣壳在食蟹猴和C57Bl/6J小鼠脑中的表现对比。在猕猴脑中相对AAV9富集度＞10倍的衣壳以橙色突出显示。(D) 来自(C)中富集程度最高的衣壳的VR-IV肽插入序列。6氨基酸插入位置以下划线标示；保守的SPH基序及邻近带正电的残基分别以红色和蓝色突出显示。(E) 富集程度最高的衣壳插入肽的位置与序列保守性。上图：由(C)中前13条序列得到的共有序列。红色标注的456–458位对应保守的SPH基序。下图：VR-IV环在VCAP-102中的冷冻电镜三维结构。插入的6氨基酸肽以红色高亮，对应于上图方框中的454–459位。

二、VCAP-102在啮齿类和灵长类动物中表现优异

1. VCAP-102在小鼠中的表现

研究团队通过静脉注射方式（1×10¹³ VG/kg）向BALB/c小鼠递送携带报告基因的VCAP-102，并与标准AAV9进行对比。结果显示，VCAP-102在整个大脑和脊髓中均呈现广泛分布，其病毒DNA生物分布和转基因RNA表达水平比AAV9高出约20-40倍（图2）。

更值得注意的是，VCAP-102在肝脏中的表达显著降低，相比AAV9减少了14倍，这对降低肝脏毒性、提高治疗安全窗口具有重要意义。

剂量梯度研究表明，VCAP-102呈现良好的剂量依赖性响应，在最高剂量（1×10¹⁴ VG/kg）下，能转导皮层中高达40%的细胞，且在神经元和星形胶质细胞之间分布均匀。

三、ALPL：VCAP-102跨BBB的关键受体

为了理解VCAP-102穿透BBB的分子机制，研究人员采用了两种互补的策略：Retrogenix细胞微阵列筛选人类表面蛋白，以及使用慢病毒人类ORFeome文库的转导筛选。两种方法均鉴定出ALPL（碱性磷酸酶，又称组织非特异性碱性磷酸酶TNAP）作为最特异的相互作用分子。

ALPL是一种高度保守的GPI锚定细胞表面蛋白，在肝脏、骨骼、肾脏和大脑等多种组织中表达。在大脑中，ALPL主要表达于内皮细胞，这支持其在BBB转运中的潜在作用。

1. ALPL是VCAP-102的主要受体

通过一系列实验，研究人员证实了ALPL确实是VCAP-102的主要受体：

这些实验数据共同支持ALPL作为VCAP-102的主要细胞表面附着受体的角色。

2. ALPL介导VCAP-102跨BBB转运

为了证明ALPL能够介导VCAP-102跨越内皮细胞屏障，研究人员建立了一个MDCK（犬肾上皮细胞）细胞Transwell迁移模型。在这个模型中，外源表达人类ALPL诱导VCAP-102的转胞吞作用显著增加（>100倍），而对AAV9迁移无明显影响。

值得一提的是，研究人员观察到VCAP-102与ALPL形成的复合物在pH 5.5时迅速解离，这暗示了一种可能的释放机制：当衣壳被内吞后，随着内体酸化，衣壳从受体解离并释放到内皮细胞的基底侧。这一特性与其他已知的BBB转运受体配体（如转铁蛋白受体抗体）相似。

3. ALPL在体内影响VCAP-102的CNS转导

研究发现，ALPL在小鼠脑血管上的表达随年龄增长而增加。为验证ALPL表达水平是否会影响VCAP-102的转导效率，研究人员比较了年轻（6-8周龄）和年老（约18月龄）C57Bl/6J小鼠接受VCAP-102后的转导情况（图4）。

四、ALPL：一种高度保守的跨物种BBB转运载体

ALPL在哺乳动物中高度保守，研究人员证实VCAP-102能与人类、猕猴、小鼠和猪的ALPL在体外发生功能性相互作用。这一发现具有两方面重要意义：

1. 临床转化前景广阔：VCAP-102载体很可能在人类患者中具有良好的有效性，为CNS基因治疗提供了一个有力的候选载体；
2. 研究模型的便利性：VCAP-102可在常见动物模型中有效使用，无需替代载体或人源化转基因动物，极大简化了未来CNS靶向治疗的研发过程。

ALPL的跨物种保守性使VCAP-102成为一种真正的”通用型”CNS基因递送载体，有望克服以往AAV载体在种属间转化面临的挑战。

此外，鉴定ALPL作为受体的另一个关键优势是能够预测患者群体中的基因递送水平。研究观察到VCAP-102转导与ALPL表达水平之间存在强相关性，如在ALPL表达水平较高的狨猴和老年小鼠中表现出惊人的高转导效率。

五、VCAP-102在基因治疗领域的应用前景

VCAP-102在多种动物模型中展现的优异性能，为CNS基因治疗开辟了广阔前景：

1. 提高治疗安全窗口

相比AAV9，VCAP-102显著提高了CNS转导效率，同时降低了肝脏转导。这一特性有望在较低剂量下实现临床有效的CNS基因转移，同时最小化肝脏毒性，从而提高治疗安全窗口。

VCAP-102在1×10¹³ VG/kg剂量下即能有效转导大量脑细胞，这一剂量远低于AAV9基因治疗产品Zolgensma使用的1×10¹⁴ VG/kg剂量，且完全在公认的AAV治疗安全范围内。

2. 适用于各类基因治疗策略

研究表明，VCAP-102无论携带单链基因组还是自互补基因组，都能实现高效转导，这意味着它适用于各类治疗策略，包括基因替代、基因沉默和基因编辑等。

3. 覆盖广泛的细胞类型

VCAP-102能有效转导脑内多种细胞类型，包括神经元和星形胶质细胞，使其可用于针对不同类型CNS疾病的治疗，如神经退行性疾病、代谢性疾病和脑发育障碍等。

4. ALPL作为BBB转运载体的广泛应用

除了AAV载体，ALPL还可能被用于改善其他非病毒递送模式的BBB穿透能力，如抗体、纳米抗体、肽和适配体等。这为开发新一代CNS靶向生物治疗剂提供了新途径。

六、结论与展望

VCAP-102的发现及其受体ALPL的鉴定代表了AAV载体开发领域的一项重大突破。这种跨物种CNS靶向AAV载体为克服血脑屏障这一长期挑战提供了新的解决方案，有望推动CNS基因治疗进入新时代。

尤其值得注意的是，ALPL作为一种高度保守的膜锚定受体，能够高效转运大分子复合物跨越BBB，这一特性不仅适用于AAV载体，还可能被用于改善各类生物治疗剂的CNS递送。