AAV基因组不完整性产生的原因及解决方案

在腺相关病毒（AAV）包装和生产过程中，基因组完整性是评估病毒载体质量的关键指标之一。然而，近期实践中发现，尤其是当目标基因（GOI）大于4.5 kb时，AAV包装的基因组完整性出现问题，导致CE检测显示基因组不完整。本文将探讨AAV基因组不完整性的主要原因，并提出相应的解决方案。

一、AAV基因组不完整性的主要原因

1. AAV包装容量限制

AAV的包装容量通常限制在4.7 kb左右，超过此长度的基因组难以高效包装。研究表明，当GOI长度超过5 kb时，包装效率显著下降，且包装的基因组多为不完整或截断形式 。

2. ITR序列的影响

AAV基因组的两端需要有反向终止重复序列（ITR）以供Rep蛋白识别和包装。ITR序列占用了约300 bp的空间，限制了可用于GOI的空间。此外，ITR序列的结构特性可能导致包装过程中出现截断或不完全包装 。

3. 载体设计的复杂性

在AAV载体中，除了GOI外，还需要包含启动子、增强子、内含子和多腺苷酸化信号等元件，这些元素的添加进一步增加了基因组的长度，超出了AAV的包装能力。例如，使用自互补AAV（scAAV）设计时，由于包装容量的限制，可能导致包装的基因组不完整。

4. 包装过程中的随机性

在AAV包装过程中，Rep蛋白在识别ITR序列后进行切割和包装。由于包装过程的随机性，可能导致部分AAV颗粒仅包含一个ITR序列或部分基因组，从而形成不完整的AAV颗粒。

二、解决方案与优化策略

1. 优化载体设计

• 精简启动子和增强子：使用小型启动子（如miniCMV）和增强子，以减少载体的整体长度。

• 选择紧凑的内含子和多腺苷酸化信号：例如，使用SV40内含子和简化的多腺苷酸化信号，以节省空间。

• 使用小型GOI：如果可能，选择较小的GOI或使用迷你基因版本，以适应AAV的包装限制。

2. 采用双AAV载体策略

对于超过包装容量的GOI，可以采用双AAV载体策略，将GOI分割成两个部分，分别包装在两个AAV颗粒中。常见的策略包括：

• 重叠策略：在两个载体之间设计重叠区域，通过同源重组实现GOI的重组。

• 转录后拼接策略：在两个载体中分别包含GOI的不同部分，通过细胞内的拼接机制实现完整GOI的表达。

这些策略可以有效克服AAV包装容量的限制，但需要注意拼接效率和表达水平的优化。

3. 优化包装条件

• 选择合适的AAV血清型：不同的AAV血清型对包装容量和组织特异性有不同的影响。例如，AAV9和AAVDJ的包装容量相对较大，适用于较长的GOI。

• 优化包装体系：使用高效的包装细胞系和辅助质粒系统，以提高包装效率和完整性。

4. 高效的病毒纯化方法

采用高效的病毒纯化方法，如梯度离心和亲和层析，可以提高完整AAV颗粒的纯度，减少空包和部分包装的颗粒，从而提高基因组的完整性。

三、总结

AAV基因组不完整性是AAV包装和生产过程中常见的问题，尤其是当GOI长度超过4.5 kb时。通过优化载体设计、采用双AAV载体策略、优化包装条件和提高病毒纯化效率，可以有效提高AAV基因组的完整性，确保基因治疗的效果。在实际操作中，建议根据具体的GOI特性和应用需求，灵活选择合适的策略，以实现最佳的包装效率和基因组完整性。