AAV基因治疗的“暗礁”：我们该如何面对基因组不完整性？

作为基因治疗领域最炙手可热的“明星载体”，腺相关病毒（AAV）以其低免疫原性、高安全性和持久的基因表达能力，在众多遗传病的治疗中展现出巨大潜力 。然而，在AAV的生产和应用实践中，一个棘手的技术难题日益凸显，那就是AAV基因组的不完整性。

尤其当需要递送的基因（GOI）较大，基因组尺寸超过AAV的“天然装载极限”（约4.7kb）时，我们常常在质量检测中（如毛细管电泳）发现大量的基因组片段，而非我们期望的完整“货物” 。这种不完整的基因组不仅无法在靶细胞内表达出功能蛋白，还可能引发非预期的免疫反应，从而严重影响治疗效果和安全性 。

那么，导致AAV基因组不完整的原因究竟是什么？我们又该如何应对这一挑战呢？

AAV基因组完整性及其检测方法

1. 什么是基因组完整性？

基因组完整性是指AAV基因组的结构完整性与序列准确性。重组AAV(rAAV)基因组主要包含两个关键部分：转基因表达框及其两端的反向末端重复序列(ITRs)。ITRs对病毒基因组的复制、包装乃至整合至关重要；转基因表达框则包含治疗性基因及驱动其表达所需的调控元件。任何AAV基因组的缺失、突变或重排（图1）都可能削弱载体功能，降低治疗效果，甚至带来安全性隐患。

图1 rAAV内包装的不完整基因组DNA的种类示意图

2. AAV基因组完整性的检测方法主要有哪些？

变性琼脂糖凝胶电泳：成本低廉、操作简单，可在变性条件下直观观察 AAV 基因组，但精度有限，难以用于精细分析。

毛细管电泳（CE）：是检测AAV基因组完整性的主要方法之一。其原理是通过电泳迁移时间区分不同大小的核酸分子，具有分辨率高、快速（<5分钟）、样品需求量小的优势，能够准确区分完整基因组和截断片段，提供定量信息。

定量PCR（qPCR）与微滴式数字 PCR（ddPCR）：qPCR和ddPCR常用于特异性定量 AAV 基因组序列，滴度测定灵敏且准确，但无法提供基因组长度信息，也不能发现缺失目标序列的截短或重排基因组。

纳米孔测序：可实时、低成本、长读长分析 AAV 基因组，揭示全长结构与群体异质性，且价格亲民，不足之处是碱基识别准确性和一致性还有待提高。

PacBio 测序：单分子实时（SMRT）测序，读长超长，适合分析全长 AAV 基因组，可精准鉴定结构变异、截短与重排，但成本较高。

派真生物拥有全面的AAV质量分析平台，可提供60+种AAV相关检测方法。针对AAV基因组完整性评估，我们重点提供基于毛细管电泳的高通量检测服务，日通量最高可达 5×96 个样品，高效支持同一先导序列下不同候选载体的优化筛选。同时，我们还提供多种互补方法，包括碱性琼脂糖凝胶电泳、qPCR、ddPCR、Nanopore 测序等，以满足多样化的分析需求。

AAV基因组为何会“缺斤少两”？

1.“塞翁失马”——包装超大基因组的代价

AAV的衣壳如同一个大小有限的“快递箱”，其理论上的最大装载量约为4.7kb。当我们试图“硬塞”一个超过此大小的基因组时，包装过程可能会在基因组完全进入衣壳之前就提前终止。这种“强制包装”策略虽然在某些情况下能够实现超大基因的递送，但代价就是产生大量被截短的、不完整的基因组 。

2. 包装序列的长度和二级结构

DNA分子在长度增加时，其柔性和拓扑结构变得更加复杂。Blahetek等的研究发现，基因组大小与AAV颗粒异质性之间存在明显关联：较小的AAV基因组（2.0–2.25 kb）容易发生过度填充，而较大的AAV基因组（4.5–5.0 kb）则更容易发生截断。

已有的研究表明，在 CMV 增强子、CB 启动子及 EGFP 基因等二级结构丰富的区域有“截断热点”（图2），表明序列结构是基因组断裂的关键诱因。

图2 Nanopore测序分析AAV基因组内的“截断热点”。横轴表示序列位置，纵轴为reads数量。TSAP：最高比对起始位置；TEAP：最高比对终止位置；Counts：比对序列数目（图片来源于派真生物）

Tran等研究发现，当两个sgRNA表达盒以尾对尾（tail-to-tail）方式排列时，会形成长回文结构，导致高频基因组截短，功能载体产量显著下降，而头对尾（tail-to-head）排列则未出现类似问题（图3）。

图3 sgRNA表达盒尾对尾设计对AAV基因组完整性的影响³。(A)载体基因组从ITR到ITR的示意图。箭头表示U6驱动的sgRNA的方向（正向，品红色；反向，青色）。(B) 载体信息表。自互补（sc）载体3757有两种预期大小：一种是sc形式（2.4 kb），另一种是单链（ss）形式，其大小约为前者的两倍（4.5 kb，mITR未加倍）。(C) 三种载体DNA提取后的代表性琼脂糖凝胶图，用于评估整体完整性。蓝色框表示迁移至与全长基因组大小一致的条带。红色框表示迁移至截短基因组大小的主要条带。

3. 包装信号和复制机制相关因素

如何打赢这场AAV基因组“保卫战”？

面对AAV基因组完整性这一挑战，全球的科学家们正在从多个角度探索解决方案，力求让每一颗AAV病毒都“满载而归”。

1. 优化基因盒设计——从源头减少错误

• 优化载体序列：加入设计合理的间隔序列，将启动子、Kozak序列、目的基因开放阅读框（ORF）以及polyA信号等元件进行物理分离，一方面可以为转录和翻译 machinery 提供更优的结合环境，另一方面可以减少形成稳定发夹结构或其他二级结构的可能性。为最大化AAV的有效包装空间，可以使用更小的启动子和调控元件，为更大的目的基因腾出空间。
• 避免使用易形成二级结构的设计（如尾对尾双sgRNA），以提高载体产量和功能完整性。

2. 升级生产工艺

• 优化质粒生产：采用特殊的宿主菌株和培养条件，可以有效减少ITR序列在质粒扩增阶段的突变和重组 。

• 改进病毒生产体系：无论是基于贴壁细胞还是悬浮细胞的生产系统，通过优化转染条件、收获时间以及纯化流程，都能在一定程度上减少不完整基因组的产生 。

3. 突破包装极限——递送“超大号”基因的策略

4. 精准的质量控制——用“火眼金睛”筛选出“正品”

除了传统碱性琼脂糖凝胶电泳和CE分析，新一代测序技术，特别是长读长测序技术（如Nanopore测序），为我们提供了前所未有的精确度，能够全面、深入地分析AAV产品中基因组的完整性、异质性以及杂质情况 。这为我们优化生产工艺、筛选出高质量的AAV产品提供了有力的武器。

总 结

AAV基因组的不完整性是基因治疗领域必须正视并解决的重要挑战。随着我们对基因组不完整原因的认识不断深入，通过全链条的改进，包括基因盒设计、生产工艺优化与质量控制，我们有理由相信，生产的AAV产品将具备更高的基因组完整性和更好的均一性，从而为遗传病患者带来更安全、疗效更佳的基因治疗药物。

作为专业的基因治疗服务提供商，我们深刻理解AAV基因组完整性的挑战。我们团队拥有丰富的AAV载体设计和优化经验，可以为各种规模的基因提供定制化的解决方案，帮助您克服包装限制，实现高效、安全的基因递送。无论是载体设计优化，还是生产工艺的调整，我们都能提供全流程技术支持，确保您的基因治疗项目成功实施。

参考文献

1. Brimble, Mark A. et al. (2023). Stowaways in the cargo: Contaminating nucleic acids in rAAV preparations for gene therapy. Molecular Therapy, 31(10): 2826 – 2838. https://doi.org/10.1016/j.ymthe.2023.07.025

2. Blahetek G., et al. (2025). AAV yield, bioactivity, and particle heterogeneity are influenced by genome size. Molecular Therapy Methods & Clinical Development, 33(3)：101499. https://doi.org/10.1016/j.omtm.2025.101499

3. Tran NT., et al. (2020). AAV-Genome Population Sequencing of Vectors packaging CRISPR components reveals design-influenced heterogeneity. Molecular Therapy Methods & Clinical Development, 18: 639-651