AAV 常见问题汇总：滴度不足 & 污染风险高

2025年10月13日

一、🧪 病毒滴度不足（Low AAV Titer）

1、常见原因分析

分类	典型原因	详细说明
1️⃣ 质粒问题	质粒纯度低	有残留内毒素或盐分 → 抑制转染和病毒装配。
	质粒比例不当	偏差会影响包装效率。
	质粒构建错误	ITR结构受损（如经限制酶切或冻融）会直接导致滴度极低。
2️⃣ 细胞状态	细胞密度不合适	过密或过稀都影响转染；最佳为 70–80% 融合度。
2️⃣ 细胞状态	细胞系状态差	HEK293T、HEK293AAV 等应处于旺盛分裂期。
3️⃣ 转染问题	转染效率低	转染试剂过期、比例不当、DNA浓度过高/过低。
4️⃣ 培养与收获	收获时间错误	一般推荐转染后 72–96 小时收集细胞 + 上清。
4️⃣ 培养与收获	培养条件不稳定	温度（37℃）、CO₂浓度、pH波动都会降低产量。
5️⃣ 下游处理	裂解不彻底	AAV 主要在细胞内；裂解不充分则病毒释放不完全。
5️⃣ 下游处理	纯化损失	CsCl/iodixanol 梯度或柱纯化不当 → 病毒丢失。

2、提高 AAV 滴度的实用建议

使用内毒素去除级质粒（EndoFree plasmid）。

控制细胞密度：转染时约 70–80% 融合。

优化质粒比。

优化转染体。

延长培养时间：一般 72–96 h 后收获滴度最高。

同时收集上清 + 细胞裂解物。

使用高效裂解方法：三冻融或Benzonase处理。

选择合适的纯化方式：Iodixanol 梯度离心 → 高纯度、高滴度。

定量方法可靠：qPCR、ddPCR 或 ELISA 检测病毒基因组数（vg/mL）。

二、🧫 污染风险高（High Contamination Risk）

1、主要污染来源

污染类型	来源	典型表现
细菌污染	转染体系、培养液、试剂未无菌处理	培养液混浊、pH下降
真菌污染	空气、操作区清洁不彻底	白色或黑色絮状物
支原体污染	细胞系污染或血清污染	外观正常但病毒产量显著降低
交叉污染	不同血清型AAV混用（如AAV8、AAV9）	后续实验混杂结果

2、降低污染风险的建议

严格无菌操作：全程在生物安全柜（BSC-Ⅱ级）下操作。

定期支原体检测：每月一次，用PCR或荧光法。

分区管理：
- 质粒区 / 细胞区 / 病毒区分开；
- AAV不同血清型分柜或分天操作。

使用过滤器：所有试剂、病毒上清使用 0.22 μm 滤膜过滤。

清洁消毒：
- 操作前后用 75% 酒精或1%次氯酸钠擦拭；
- 紫外灯照射至少15分钟。

规范标签与记录：
- 记录每批次细胞、质粒来源、操作人和时间。
- 避免误混或交叉。

关于派真

作为一家专注于AAV 技术十余年，深耕基因治疗领域的CRO&CDMO，派真生物可提供从载体设计、构建到 AAV、慢病毒和 mRNA 服务的一站式解决方案。凭借深厚的技术实力、卓越的运营管理和高标准的服务交付，我们为全球客户提供一站式CMC解决方案，包括从早期概念验证、成药性评估到IIT、IND及BLA的各个阶段。

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