AAV病毒感染看不到gfp荧光

问题排查思路

1. 实验设计与时间点

(1)表达时间不足（最常见的原因之一）

问题描述： AAV是单链DNA病毒，需要先在细胞核内变成双链DNA，然后才能启动转录和翻译。这个过程需要时间，尤其是对于分裂不活跃的细胞。

解决方案：

• 等待足够长的时间： 对于体外细胞实验，通常需要48-96小时才能看到较强的荧光。对于体内动物实验，可能需要2-4周才能达到峰值表达。
• 考虑使用自互补型AAV： scAAV 包装的是预先形成的双链DNA，无需在细胞内第二链合成，因此表达更快（24-48小时），且效率更高。缺点是包装容量减半。

(2)病毒滴度不足或活性问题

问题描述： 使用的病毒滴度太低，没有足够的病毒颗粒感染细胞；或者病毒在储存、运输过程中失活。

解决方案：

• 确认病毒滴度： 检查病毒产品的说明书，确认其基因组滴度（GC/mL）是否足够。对于体外实验，通常需要 1×10^11 ~ 1×10^12 GC/mL 的工作浓度，MOI（感染复数）在10,000 ~ 100,000之间进行摸索。
• 进行滴度测试： 如果病毒是实验室自己包装的，建议用qPCR重新测定滴度。
• 优化感染条件： 对于难转染的细胞（如原代细胞、神经元），可以尝试提高MOI。
• 检查病毒储存情况： AAV应保存在-80°C，避免反复冻融。冻融超过3-5次可能导致滴度显著下降。

(3)启动子不匹配

问题描述： GFP表达所使用的启动子在该细胞类型中不活跃。

解决方案：

• 使用广谱强启动子： 如CMV、CAG、EF1a等。如果这些启动子也不行，说明问题可能不在启动子。
• 使用细胞特异性启动子： 如果您使用的是特定细胞类型的启动子（如神经元的Synapsin，肝细胞的Albumin），请确认您的细胞类型是否正确，并确认该启动子是否真的适用于您的实验体系。

2. 技术与操作问题

(1)显微镜观察与设置问题

问题描述： 这是另一个非常常见的原因，尤其是对于新手。

解决方案：

• 阳性对照： 使用已知能表达GFP的细胞或病毒作为阳性对照，在相同的显微镜设置下观察。这是最关键的诊断步骤！
• 激发光/发射光滤光片： 确认您使用的是适用于GFP的正确滤光片组（激发光波长~488nm，发射光波长~510nm）。
• 激光/光强不足： 确保光源（汞灯或激光器）功率足够，并且打开了相应的激光线或光路。
• 曝光时间/Gain值： 适当增加曝光时间和Gain（增益）。但要注意，Gain过高会增加背景噪音。
• 细胞状态不佳： 如果细胞死亡或状态很差，会有很强的自发荧光（看起来像黄色或棕色的背景），掩盖了微弱的GFP信号。确保在观察时细胞健康、形态良好。

(2)细胞类型问题

问题描述： 不同细胞类型对AAV的感染效率（趋向性）天差地别。

解决方案：

• 查阅文献： 确认您使用的细胞类型是否容易被AAV感染，以及推荐使用哪种AAV血清型（如AAV2， AAV5， AAV8， AAV9等）。例如，AAV2对很多细胞系有效，而AAV9则擅长穿过血脑屏障感染神经系统。
• 使用增强感染的试剂： 对于难感染的细胞，可以尝试在感染时加入辅助试剂，如Polybrene（对于某些细胞系）或ViroMag等。

(3)AAV纯度与质量问题

问题描述： 实验室自包装的AAV可能含有大量空壳病毒（没有基因组），它们会竞争性地结合细胞受体，但不表达GFP。

解决方案： 通过氯化铯密度梯度离心或碘克沙醇梯度离心纯化病毒，以去除空壳病毒。

3. 分子生物学层面问题

(1)GFP基因序列或载体构建问题

问题描述： GFP基因本身发生突变失活，或者载体构建错误。

解决方案：

• 测序验证： 对病毒质粒进行测序，确认GFP编码序列正确无误。
• 质粒转染验证： 将包装用的质粒直接转染到HEK293T等易转染的细胞中，48小时后观察荧光。如果质粒转染也看不到荧光，那问题肯定出在质粒或GFP基因本身。