一、基本原理与系统组成
Q1：什么是慢病毒包装？
慢病毒包装是利用辅助质粒系统在包装细胞中瞬时表达病毒结构与复制相关蛋白，将携带目的基因的载体（transfer plasmid）包装成具有感染能力的病毒颗粒的过程。
Q2：慢病毒与逆转录病毒的关系是什么？
慢病毒属于逆转录病毒的一种（Retroviridae科 Lentivirus属），具有感染分裂与非分裂细胞的能力。
Q3：常见的慢病毒包装系统有哪些？
主要分为：
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三质粒系统：transfer plasmid + packaging plasmid (gag/pol/rev/tat) + envelope plasmid (VSV-G)
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四质粒系统：将 gag/pol、rev、tat、env 分离至不同质粒，提高安全性与稳定性。
Q4：包装系统中各质粒的作用分别是什么？
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Transfer plasmid：携带目的基因及LTR、ψ信号。
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Packaging plasmid：提供病毒核心蛋白（Gag、Pol、Rev、Tat）。
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Envelope plasmid：提供包膜蛋白（如VSV-G），决定宿主范围。
Q5：慢病毒系统的安全等级？
常用的第3代或第4代系统为复制缺陷型（self-inactivating, SIN），生物安全等级为 BSL-2。
二、细胞选择与培养条件
Q6：常用的包装细胞有哪些？
最常用的是 HEK293T（或293FT）细胞，因其高转染效率与T antigen可增强质粒表达。
Q7：细胞状态对包装效率有何影响？
极大影响。要求：
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细胞状态健康、无污染；
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密度在 70–90% confluent；
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代数不宜过高（建议 <30 代）。
Q8：培养基与血清选择？
通常使用 DMEM + 10% FBS，不需抗生素。包装期间避免血清更换过频或浓度突变。
三、转染与病毒收集
Q9：常见的转染方法有哪些？
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化学法：PEI、Lipofectamine；
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物理法：电转（较少用于包装细胞）。
Q10：病毒收集的时间点？
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第一次：转染后 48 小时
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第二次：72 小时（必要时再收集一次）
Q11：是否需要浓缩病毒？
如果感染目标细胞滴度需求高，可使用超速离心、PEG沉淀或商用浓缩试剂。
四、病毒滴度检测
Q12：病毒滴度有哪些检测方法？
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功能滴度（IFU或TU/mL）：感染靶细胞后测荧光或抗生素抗性。
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基因组滴度（vg/mL）：qPCR检测整合或反转录拷贝数。
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p24抗原法：ELISA测定病毒衣壳蛋白含量。
Q13：功能滴度和物理滴度有什么区别？
功能滴度表示实际感染能力，物理滴度表示病毒颗粒数量；二者并非线性对应。
五、常见问题与故障排查
Q14：感染后无荧光或表达？
可能原因：
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目的基因或启动子无效；
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滴度过低；
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目标细胞不敏感；
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感染条件不佳（MOI不足、时间短）；
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抗生素筛选浓度错误。
Q15：包装效率低或滴度偏低？
排查方向：
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质粒比例不合适；
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转染效率低（PEI质量、DNA纯度、细胞状态）；
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细胞密度过高/过低；
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培养基或血清质量问题；
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过早/过晚收集上清。
Q16：病毒收集后污染或活性丢失？
可能原因：
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过滤器堵塞或细菌污染；
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多次冻融导致包膜破裂；
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储存条件不当（应分装，-80°C保存）。
Q17：感染效率高但细胞死亡严重？
可能原因：
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VSV-G包膜毒性；
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高MOI造成细胞应激；
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目的基因本身具有细胞毒性。
Q18：病毒浓缩后出现沉淀或絮状物？
可能原因：
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PEG过量；
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未充分溶解；
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低温条件下蛋白聚集。
Q19：长期保存病毒活性下降？
慢病毒在 -80°C 稳定数月，但冻融 >2 次会显著降低感染力。应 小体积分装 保存。
六、优化建议
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使用高质量内毒素去除质粒。
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转染前换新鲜培养基。
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尽量避免抗生素。
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收集上清时过滤除细胞碎片。
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如需高滴度，可尝试病毒浓缩或超速离心。
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