AAV病毒包装常见问题（FAQ）

Ⅰ. 基本原理与系统组成

Q1：什么是AAV病毒包装？

AAV（腺相关病毒，Adeno-Associated Virus）包装是指在包装细胞中共转染多种质粒，通过瞬时表达病毒所需的辅助基因，使携带目的基因的AAV载体（含ITR结构）被包装成感染性重组AAV颗粒的过程。

Q2：AAV的基本结构是什么？

天然AAV基因组为单链DNA，主要包含两个基因区域：

• rep基因：负责病毒基因组复制与整合；

• cap基因：编码病毒衣壳蛋白（VP1、VP2、VP3）。两端的 ITR序列（inverted terminal repeat）是病毒基因组复制和包装的必要信号。

Q3：AAV能否独立复制？

不能。AAV为“依赖型病毒”，必须在存在辅助病毒（如腺病毒或疱疹病毒）或提供相应辅助因子的条件下才能复制。实验中通过辅助质粒提供这些因子来实现。

Q4：AAV包装系统包含几个质粒？

常见为 三质粒系统：

1. Transfer plasmid（载体质粒）：携带目的基因，位于ITR之间。

2. Rep/Cap plasmid：提供AAV的rep与cap基因。

3. Helper plasmid：提供来自腺病毒的辅助因子（E2A、E4、VA RNA等）。

Q5：什么是双质粒系统？

将Rep/Cap与Helper基因整合至同一个质粒，只需与transfer质粒共转染即可完成包装。此法提高了简便性和一致性，但灵活性较低。

Ⅱ. 细胞选择与培养条件

Q6：常用的AAV包装细胞有哪些？

HEK293T 细胞是最常用的包装细胞，因为其内源表达腺病毒E1基因，可有效支持AAV复制与包装。

Q7：细胞状态对包装效率的影响？

影响非常显著：

• 最佳接种密度为 70–90%融合度；

• 细胞应处于活跃增殖状态，无污染；

• 代数不宜过高（<30代）；

• 低营养或过度密集都会降低病毒滴度。

Q8：培养条件？

推荐：DMEM + 10% FBS，不加抗生素，37°C、5% CO₂恒温培养。包装过程中避免频繁换液或血清浓度变化过大。

Ⅲ. 转染与病毒收集

Q9：AAV包装常用的转染方法？

• 化学法：PEI（常用）、Lipofectamine、CaCl₂-磷酸钙法；

• 其中 PEI 因性价比高、可放大性强，最为常用。

Q10：病毒收集时间？

• 第一次：转染后 48小时；

• 第二次：转染后 72小时；
  每次收集上清液后使用 0.45 μm过滤膜 去除细胞碎片。

Ⅳ. 病毒纯化与滴度检测

Q12：AAV的常见纯化方法？

• 碘克沙醇（Iodixanol）密度梯度离心法（实验室标准方法）；

• CsCl密度梯度离心法（传统但操作复杂）；

• 亲和层析法（Affinity Chromatography），如AVB column（适合大规模制备）。

Q13：如何检测AAV滴度？

常见方法包括：

1. qPCR法：检测ITR或转基因序列 → 得到 基因组滴度（vg/mL）；

2. ELISA法：通过抗体检测AAV衣壳蛋白含量；

3. 点杂交（Dot blot）或Southern blot：检测病毒DNA；

4. 功能滴度法：感染目标细胞后测定基因表达效果。

Q14：vg/mL是否代表真实感染能力？

不是。vg/mL反映的是物理颗粒数，而非全部具备感染能力。实际感染性颗粒通常仅占总量的10–50%。

Ⅴ. 常见问题与故障排查

Q15：AAV滴度太低的原因？

可能原因包括：

• 转染效率不足（DNA纯度低、PEI质量差、细胞状态差）；

• 收集时间不合适；

• Rep/Cap质粒血清型不匹配；

• Helper质粒活性不足；

• 培养基老化或营养不足。

Q16：纯化后病毒回收率低？

可能原因：

• 密度梯度操作不准确；

• 离心层取样错误；

• 样品过度稀释；

• 滤膜或离心管吸附造成损失。

Q17：感染后目的基因表达弱？

可能原因：

• 启动子活性不足；

• AAV血清型与目标细胞不匹配；

• 感染MOI偏低；

• 目的基因本身表达效率低。

Q18：AAV出现凝集或沉淀？

可能原因：

• 病毒浓度过高导致颗粒聚集；

• 溶液pH不稳定；

• 保存条件不当。

• 解决方法：可在储存液中加入 0.001% Pluronic F-68 并保持PBS pH 7.4。

Q19：AAV如何保存？

• 短期（1周以内）：4°C保存；

• 长期保存：-80°C小体积分装，避免反复冻融。

Ⅵ. 效率提升与优化建议

• 使用高纯度、去除内毒素的质粒；

• 转染前更换新鲜培养基；

• 避免使用抗生素；

• 上清收集后及时过滤除杂；

• 如需高滴度：可进行超速离心或柱层析浓缩；

• 合理选择AAV血清型（如AAV2、AAV8、AAV9等）以匹配不同组织靶向性