一、AAV包装阶段常见问题
| 问题 | 可能原因 | 解决建议 |
| 1. 病毒滴度低 | – 转染效率低（细胞状态差、质粒比例不合适） | – 优化细胞密度与转染条件 |
| – 质粒纯度不足（内毒素污染） | – 使用内毒素去除型高纯质粒 | |
| – 包装细胞未达最佳密度（如HEK293T未达70–80%融合） | – 检查Rep/Cap和辅助质粒是否对应 | |
| – 包装系统设计不合理（质粒比例、血清型与载体不匹配） | – 延长收集时间至72–96h | |
| 2. 细胞死亡率高 | – 过量转染试剂或DNA | – 减少转染剂量 |
| – 质粒内毒素超标 | – 使用高纯质粒 | |
| – 培养条件异常 | – 检查培养基和CO₂环境 | |
| 3. 包装后上清污染严重 | – 无菌操作不规范 | – 加强无菌操作 |
| – 过滤步骤不彻底 | – 0.22 μm过滤上清后再纯化 |
二、AAV纯化与浓缩阶段问题
| 问题 | 可能原因 | 解决建议 |
| 1. 病毒回收率低 | – PEG沉淀或梯度离心条件不当 | – 优化PEG浓度、pH与离心力 |
| – 滤膜吸附严重 | – 选择低吸附滤膜（PVDF） | |
| – 多次冻融导致失活 | – 避免反复冻融 | |
| 2. 病毒样品浑浊或凝集 | – 蛋白质或DNA杂质未清除 | – 加入少量Tween-20（0.001–0.01%） |
| – 高浓度AAV易自聚集 | – 降低浓缩倍数 | |
| – 低温保存（4°C短期，-80°C长期） | ||
| 3. 滴度测定结果不稳定 | – qPCR引物设计不合理 | – 优化qPCR引物与模板 |
| – 标准品不准确 | – 使用线性化标准质粒 | |
| – 保证样品提取方法一致 |
三、AAV感染与转导阶段问题
| 问题 | 可能原因 | 解决建议 |
| 1. 感染后无荧光/无表达 | – 细胞不适合该血清型（受体不匹配） | – 更换合适血清型（如AAV2 vs AAV9） |
| – 滴度不足或MOI太低 | – 提高感染剂量或重复感染 | |
| – 目的基因启动子活性差 | – 选择对目标细胞高活性的启动子 | |
| 2. 感染效率低 | – AAV被细胞外基质阻挡 | – 去除血清或使用Poly-L-Lysine助转 |
| – 未优化感染时间 | – 延长感染时间（24–48h） | |
| 3. 动物实验转导效率不理想 | – AAV血清型与组织特异性不匹配 | – 根据靶组织选择血清型（如AAV8/9肝脏，AAV-PHP.eB中枢） |
| – 注射途径不当 | – 优化给药途径（静脉、脑内、肌肉等） | |
| – 免疫清除作用 | – 使用免疫抑制策略（如短期糖皮质激素） |
四、保存与使用问题
| 问题 | 可能原因 | 解决建议 |
| 1. 病毒活性下降 | – 多次冻融或储存温度不当 | – 分装储存于-80°C |
| – 保存缓冲液成分不合理 | – 使用含0.001% Pluronic F-68的PBS或Tris缓冲液 | |
| 2. 长期保存后污染 | – 无菌保存不彻底 | – 加入少量抗生素（如0.05%青链霉素） |
| – 管口反复暴露 | – 严格无菌操作 |
五、实验设计层面常见误区
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❌ 载体过大：AAV包装上限约 4.7 kb（含ITR），超过则滴度骤降。
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❌ 未考虑单链/自互补AAV差异：scAAV转导快但载体容量减半。
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❌ 使用错误的血清型或启动子：不同细胞/组织特异性差异极大。
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❌ 忽略空壳比例：过多空壳会稀释功能性颗粒，影响结果。
关于派真
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