慢病毒包装通常指在 HEK293T 细胞中通过瞬时转染多种质粒，使其产生具有感染能力的重组慢病毒颗粒。核心原理是利用包装系统提供病毒结构与复制必需元件，而目的载体提供转基因表达框架。
一、包装系统类型
1. 三质粒系统（最常见）
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转移载体（Transfer Vector）：携带目的基因（GFP、shRNA、cDNA 等）
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包装质粒（Packaging Plasmid，gag/pol、rev）：提供结构蛋白与复制相关蛋白
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包膜质粒（Envelope Plasmid，VSV-G）：提供病毒包膜，决定病毒宿主范围
2. 四质粒系统（更安全）
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Transfer vector + gag/pol + rev + VSV-G
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将 gag/pol 与 rev 进一步分离，提高生物安全性，降低重组风险。
二、包装细胞
一般选择 HEK293T：
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转染效率高
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可高表达 gag/pol 和 VSV-G
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产毒效率高
目标：细胞状态良好、贴壁饱满但未过度融合（70–90% confluency）。
三、转染步骤（通用流程）
1. 细胞准备
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前一天按密度铺板
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第二天细胞长到 70–90%即可转染
2. 配制 DNA 混合物
常见质粒比例（示例）：
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Transfer vector：包装质粒：包膜质粒 = 4 : 3 : 1 （质量比）
四质粒系统则根据公司/实验室 SOP 调整。
3. 转染（常用方法：PEI、Lipofectamine 3000）
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按标准操作混合 DNA + 转染试剂
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室温孵育 15–20 min
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加到细胞中，轻轻摇匀
4. 细胞培养
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6–8 小时后根据需要换液（可不换）
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32–37°C 培养（32°C 可提升滴度但速度慢）
四、收集病毒上清
收集时间点：
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48 h
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72 h（必要时 96 h 再收一次）
处理步骤：
1.收集上清
2.300 × g、5 min 去除细胞碎片
3.0.45 μm 滤膜过滤
4.可直接使用或进行浓缩（超滤柱/PEG/超速离心）
五、病毒浓缩方法（任选）
1. 超滤柱（Ultrafiltration）
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快速、安全、最常用
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使用 100 kDa cutoff 的 Amicon 等滤杯
2. PEG 沉淀
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成本低
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会残留 PEG，不适合某些下游实验
3. 超速离心（Ultracentrifugation）
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滴度最高
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需要大型设备，操作复杂
六、病毒滴度检测
常见方法：
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功能滴度（TU/mL）：感染细胞后测 GFP 或抗性
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qPCR 滴度（viral RNA copies）
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p24 ELISA（间接）
七、常见影响因素
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细胞密度不佳、状态差
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DNA 质量低或比例不合适
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转染效率差
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VSV-G 表达不足
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目的基因太大（> 8–9 kb 影响滴度）
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上清保存时间过长或冻融次数多
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