慢病毒（Lentivirus）包装常见疑问

慢病毒（Lentivirus）包装常见疑问 Q&A

1. 慢病毒包装一般需要多长时间？

通常 48–72 小时即可看到明显的病毒颗粒生成；72 小时达到较高滴度；96 小时通常是收集的最晚时间点。

2. 三质粒 vs 四质粒系统有什么区别？哪种更好？

• 三质粒系统：Transfer plasmid + psPAX2（gag/pol/rev）+ pMD2.G（VSV-G）

• 四质粒系统：将包装组分拆得更细，安全性提升，滴度也通常更高。
  总体来看，四质粒系统安全性更高，滴度稍优。

3. 目的基因多大可以包装？

慢病毒有效包装上限一般 ~8–9 kb（包含载体骨架）。
超过 9 kb 容易导致 滴度显著下降 或 病毒不稳定。

4. 目的基因太大怎么办？

可选方案：

• 拆分成 双载体系统（Split LV）

• 缩短载体骨架

• 使用 AAV、PiggyBac 等替代系统

5. 转染效率低会影响滴度吗？

会。转染效率是决定滴度的关键因素之一，使用良好状态的 HEK293T 细胞、优化 DNA/转染剂比例非常关键。

6. 为什么培养基颜色变黄了？

大多是因为细胞高密度或代谢旺盛导致 pH 降低，属于正常现象。
但如果太早变黄（24h 内），需检查：

• 转染剂毒性

• 293T 细胞状态

• 血清质量

7. 收集的病毒上清需要过滤吗？

推荐 0.45 μm 过滤，去除细胞碎片，避免下游感染不稳定。

8. 病毒保存方式？能冻融几次？

• -80°C 保存可维持数月

• 尽量避免冻融，每一个冻融循环都会降低滴度 20–50%
  建议分装保存。

9. 滴度测定方法有哪些？

常见滴度测定方式：

• qPCR/RT-qPCR：测基因组拷贝

• 功能滴度（TU）：感染细胞后计算阳性率

• p24 ELISA：测胶套蛋白含量（参考性强，准确性较弱）

10. 感染细胞后什么时候能看到荧光？

一般 48–72 小时出现荧光。
过慢可能是：

• MOI 太低

• 荧光蛋白表达弱

• 细胞状态不佳

• 感染步骤不充分（如无 Polybrene）

11. 为什么病毒滴度很低？常见原因是什么？

可能来自：

• 293T 细胞状态差

• DNA 质量问题（内毒素残留）

• 基因过大

• 载体构建问题（如无 LTR）

• 转染剂比例不合适

• 上清收集时间不对

• 未过滤或离心导致病毒丢失

12. 使用慢病毒有安全风险吗？

研究级慢病毒（第二/三/四代载体）均去除了复制能力，一般不会感染实验人员。
若被针扎等接触：

• 立即清洗

• 使用70%酒精消毒

• 上报与医学观察
  实际发生严重事件的概率极低。