慢病毒包装注意事项

一、质粒相关（核心要点）

1. 质粒纯度必须高

   • OD260/280：1.8–2.0

   • Endotoxin-free（无内毒素）质粒尤为关键，否则会影响转染效率与毒滴度。

2. 质粒比例要准确

   • 三质粒系统一般为：
     Transfer plasmid : Packaging plasmid : Envelope plasmid = 4 : 3 : 1（质量比）

   • 四质粒系统需保持不同的 Helper 质粒比例，确保 Gag/Pol、Rev、VSVG 数量合理。

3. 质粒大小与基因长度限制

   • 目的基因超过 4.5 kb 会显著降低滴度。

   • 超过 8 kb 基本会影响包装成功率。

二、细胞相关（HEK293T）

1. 细胞状态要好

   • 健康、无污染、无支原体。

   • 贴壁密度 70–90% 最适合转染。

2. 细胞不要过度传代

   • 推荐在 P5–P20 范围内使用的 293T，活力最好。

3. 培养条件稳定

   • 37℃、5% CO₂，培养基建议使用 高糖 DMEM + 10% FBS（非热灭活）。

三、转染步骤注意事项

1. 选择合适的转染试剂

   • 通常使用 PEI 或 Lipofectamine 3000；PEI 需注意 pH 7.0–7.1 最佳。

2. 操作时保持无菌

   • 所有操作尽量在生物安全柜内进行。

3. 换液策略正确

   • 使用 PEI 体系时，通常 6–8h 后换液 可避免毒性过高。

   • 使用 Lipo 时通常 不换液。

4. 转染体系要新鲜

   • DNA/转染试剂复合物必须在制备后 20 分钟内使用。

四、收集病毒上清

1. 采集时间

   • 常规为 48h、72h 各收一次。

   • 滴度最高常在 48–60h。

2. 上清需要过滤

   • 使用 0.45 μm 滤膜（PVDF 或 PES），避免病毒被吸附。

3. 避免反复冻融

   • 慢病毒对冻融极为敏感——一次冻融即可损失 50%+ 滴度。

五、病毒浓缩与保存

1. 浓缩方法

   • 超速离心

   • PEG/PEG8000 法

   • 商业化 Lenti concentrator

   → 超速离心效果最好但时间最长、对病毒剪切大。

2. 保存条件

   • −80℃分装保存，小管量 ≤ 50–100 μL，避免反复冻融。

   • 操作时要快速，病毒对温度敏感。

六、生物安全注意事项（重点）

1. 慢病毒为 BSL-2 级别操作材料

   • 全程需使用 二级生物安全柜 和适当 PPE（手套、实验服）。

2. 含有包装病毒的废弃物必须灭活

   • 使用含氯消毒液浸泡至少 30 分钟再处理。

3. 避免锐器伤与气溶胶

   • 任何针刺、喷溅均可能造成意外暴露。

4. 若不慎接触皮肤/眼睛

   • 立即用大量清水冲洗

   • 视严重情况进行医学评估

七、提高病毒滴度的实战技巧

• 使用 Opti-MEM 作为转染体系

• 选择 高活力的 293T（如刚复苏 1–2 代）

• 控制培养基 pH 不偏酸

• 转染前 24h 换新鲜培养基