AAV包装过程中易发生什么污染

AAV 包装过程中最常见的污染类型主要包括以下几类，主要来自细胞、质粒、实验环境或操作不当造成。

一、细胞相关污染

1. 微生物污染（最常见）

• 细菌污染：培养液变浑浊、pH 降低、细胞死亡速度加快。

• 真菌/酵母污染：可见菌丝或白色絮状物。

• 支原体污染（Mycoplasma）：无肉眼可见迹象，但会显著降低 AAV 产量和感染力。

2. 细胞交叉污染

• HEK293、HEK293T、HEK293FT 等细胞系混杂或被其他细胞系污染，会影响包装效率和病毒质量。

二、质粒相关污染

1. 质粒内毒素污染

• 高内毒素会抑制细胞生长，降低 AAV 产量。

• 采用 Endotoxin-free 纯化很关键。

2. 质粒纯度不够/剪切片段污染

• 线性化、大片段或宿主基因组 DNA 混入会导致包装效率下降。

3. 质粒间交叉污染

• 转染时混入错误质粒或质粒比例不准确，造成病毒基因组异常或滴度降低。

三、病毒相关污染

1. 上一批病毒残留

• 未彻底清洗的离心管、过滤器或超速机适配器可能带入上一次实验的病毒。

2. 野生型 AAV（wtAAV）污染

• 由 ITR 重组或质粒之间的同源重组导致。

• 可引起安全性问题、改变病毒基因组组成。

3. 交叉血清型污染

• 在同一实验室中并行包装多种血清型时易发生，无菌分区不明确时风险更高。

四、实验操作/环境污染

1. 非无菌条件导致的微生物污染

• 主要来自移液器、过滤器、培养箱、未灭菌耗材等。

2. 环境核酸污染

• 气溶胶中的 DNA 或 PCR 片段可能被包装进病毒，特别是在高拷贝质粒实验室环境中。

五、蛋白或其他杂质污染

1. 外源蛋白污染

• 包装过程中可能引入细胞碎片、蛋白、胞外囊泡等，影响纯化后的病毒质量。

2. 细胞碎片污染

• 上清收集或裂解未充分处理，会带入大量蛋白杂质，降低纯度。

如何减少污染（核心要点）

• 使用 无菌操作、洁净台、灭菌耗材。

• 使用 支原体检测合格的细胞株。

• 所有包装质粒用 无内毒素级。

• 分区操作不同血清型或不同批次病毒。

• 每次实验前后彻底清洁设备（如超速机管、过滤柱、离心管）。

• 定期做支原体检测和环境监控。