aav三质粒包装系统 裂解细胞

1️⃣ 背景

AAV三质粒系统通常包括：

1. 转基因载体质粒（ITR质粒）：含目的基因以及AAV两端的反向末端重复序列（ITR）。

2. 包装质粒（Rep/Cap质粒）：提供AAV复制（Rep）和衣壳蛋白（Cap），不同血清型选择不同Cap。

3. 辅助质粒（Ad helper质粒）：提供腺病毒辅助因子（E2A、E4、VA RNA），支持AAV有效复制。

三质粒共转染后，HEK293细胞会在 48–72 小时开始产生重组AAV（rAAV）。

2️⃣ 裂解细胞目的

AAV主要存在于 细胞内，少量释放在培养基中，因此收获病毒时需要裂解细胞释放病毒颗粒。裂解的核心目的是：

• 打破细胞膜释放病毒

• 保持病毒颗粒完整

• 去除大部分细胞碎片和核酸

3️⃣ 常用裂解方法

（1）冻融法

• 将收获的细胞悬液反复冻融 3 次（-80℃冷冻 → 37℃水浴解冻）。

• 优点：简单，不需要额外试剂

• 缺点：效率较低，可能有少量病毒损失

（2）化学裂解法

• 使用缓冲液 + 非离子型去污剂（如 Triton X-100 0.5%）

• 可加 DNase I / RNase 降解游离核酸，降低粘度

• 适合大规模病毒制备

（3）机械破碎法

• 超声波（sonication）或高压均质

• 效率高，但需注意不要过度处理导致病毒颗粒损伤

4️⃣ 裂解后处理

• 去除细胞碎片：离心（如 3000–5000 g，10 min），保留上清液

• 浓缩病毒：可通过 PEG沉淀、密度梯度离心（CsCl 或 Iodixanol） 或 柱层析 获取高纯度病毒

5️⃣ 注意事项

1. 温和处理：避免过度剪切或高温损伤AAV

2. 保持pH和盐浓度稳定：一般使用PBS或Tris缓冲

3. 无内毒素条件（尤其用于体内实验）