腺相关病毒（AAV）介导的基因干扰与基因敲除

腺相关病毒（Adeno-Associated Virus，AAV）因其安全性高、免疫原性低、可长期表达等特点，被广泛应用于体内（in vivo）和体外（in vitro）的基因功能研究。根据研究目的的不同，AAV 常被用于介导基因干扰（knockdown）或基因敲除（knockout）。二者在作用机制、实验设计和适用场景上存在显著差异。

一、AAV 介导的基因干扰（Gene Knockdown）

1. 技术原理

AAV 介导的基因干扰是通过递送干扰元件，降低目标基因的表达水平，而不改变基因组 DNA 序列。该策略主要作用于转录或转录后水平，具有可逆性。

2. 常用实现方式

• shRNA / miRNA 介导的 RNA 干扰（RNAi）
  AAV 表达 shRNA 或人工 miRNA，经细胞内 RNAi 通路降解目标 mRNA。

• CRISPRi（CRISPR interference）
  通过 AAV 递送 dCas9 及转录抑制结构域（如 KRAB），靶向启动子或转录起始位点，抑制基因转录。

3. 技术特点

• 不引入 DNA 双链断裂

• 基因表达下调程度通常为 50–90%

• 表达效应相对温和，可逆性强

• 对细胞毒性和基因组稳定性影响较小

4. 适用场景

• 目标基因为必需基因或完全敲除会导致致死

• 需要研究基因剂量效应

• 长期 in vivo 表达模型（如神经系统、心脏等）

二、AAV 介导的基因敲除（Gene Knockout）

1. 技术原理

AAV 介导的基因敲除是通过递送基因编辑系统，直接破坏目标基因的 DNA 序列，导致基因功能缺失，该过程通常不可逆。

2. 主要实现策略

2.1 AAV-CRISPR/Cas9 系统

AAV 递送 sgRNA 及 Cas9 蛋白（或在转基因 Cas9 模型中仅递送 sgRNA），通过非同源末端连接（NHEJ）修复产生移码突变，从而实现基因敲除。

2.2 AAV-Cre 条件性敲除

在 flox 小鼠模型中，通过 AAV 定点递送 Cre 重组酶，实现特定组织、特定细胞类型或特定时间点的基因敲除，是 in vivo 研究中应用最为广泛的策略之一。

3. 技术特点

• 基因组层面的永久性改变

• 敲除效率受感染效率、sgRNA 设计及 Cas9 表达水平影响

• in vivo 实验中可能存在嵌合现象（mosaicism）

• 需进行基因型和蛋白水平验证

4. 适用场景

• 明确研究基因功能缺失效应

• 疾病模型构建

• 行为学和发育生物学研究

• 组织或细胞类型特异性研究

三、AAV 介导的基因干扰与敲除对比

四、实验设计中的关键注意事项

1.AAV 本身仅作为递送载体，并不直接介导基因干扰或敲除，真正发挥作用的是 RNAi、CRISPR 或 Cre-loxP 系统。

2.shRNA 表达过强可能引发 RNAi 相关毒性，尤其在神经系统中需谨慎优化表达水平。

3.受 AAV 载量限制，Cas9 常需采用双 AAV 系统或选择小型 Cas9（如 SaCas9）。

4.in vivo 敲除实验应结合基因组、mRNA 和蛋白水平进行多层次验证。

AAV 介导的基因干扰和基因敲除是当前基因功能研究中的两种核心策略。基因干扰适用于需要部分抑制基因表达或避免致死效应的研究，而基因敲除更适合解析基因的必需性和功能缺失表型。在具体实验设计中，应根据研究目的、目标组织及实验周期合理选择合适的 AAV 递送方案。